Hans Journal of Biomedicine
Vol.2 No.3(2012), Article ID:804,3 pages DOI:10.12677/HJBM.2012.23005
Anti-Tumor Activity of the Peptide from Bullacta exarata
School of Food and Pharmacy, Donghai Science and Technology College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan
Email: *chymjy@zjou.edu.cn
Received: May 30th, 2012; revised: Jun. 29th, 2012; accepted: Jul. 5th, 2012
ABSTRACT：
Objective: To isolate and purify the peptide from Bullacta exarata, and study its anti-tumor effect on prostate cancer. Methods: The antimicrobial peptides were hydrolyzed from soft tissues of Bullacta exarata by trypsin, and purified by sephadex chromatography. Measured by MTT assay in vitro anti-tumor activity and cell morphology was observed by fluorescence staining. Results: The components separated from membrane (molecular weight 5 - 10 KD)and isolated by the Sephadex G-75 could inhibitse the PC-3 cells growth, and the latter stronger than the former. Conclusion: The Bullacta peptides could inhibitse the PC-3 cells growth and have anti-tumor activities on prostate cancer.
Keywords: Peptides of Bullacta Exarata; Anti-Tumor; Enzymatic; Prostate Cancer
泥螺多肽抗肿瘤活性的初步研究
林焕乐，励芝伊，陈 博，易忠达，王泽峰，马剑茵*
浙江海洋学院东海科学技术学院食品与药学系，舟山
Email: *chymjy@zjou.edu.cn
摘 要：
目的：提取分离泥螺软体组织，探索其体外抗肿瘤活性。方法：采用胰蛋白酶酶解法获得泥螺多肽粗提物，通过超滤膜滤过技术获得分子量在5~10 kDa的组分。用葡聚糖凝胶G-75分离、纯化，MTT法测定其体外抗肿瘤活性并用荧光染色法观察细胞形态。结果：经膜分离得到的组分(分子量5~10 KD)和经葡聚糖凝胶G-75分离得到的泥螺多肽对前列腺PC-3肿瘤细胞均有一定的抑制作用，且后者强于前者。结论：泥螺多肽具有一定的抗前列腺PC-3肿瘤细胞的活性。
收稿日期：2012年5月30日；修回日期：2012年6月29日；录用日期：2012年7月5日
关键词：泥螺多肽；抗肿瘤；酶解；前列腺癌
1. 引言
泥螺(Bullacta exarata)，俗称“吐铁”、“黄泥螺”、“梅螺”等[1]，隶属于腹足类后鳃亚纲软体动物，由贝壳和软体两部分组成，为西太平洋沿岸半咸水滩涂的习见种类，广泛分布于我国南北沿海潮间带滩涂，是典型潮间带底栖匍匐动物，多栖息在中底潮带，泥沙或沙泥的滩涂上，在风浪小、潮流缓慢的海湾中尤其密集，以东海和黄海产量最多。其生物体内蛋白含量丰富，多肽物质丰富。
一些生物活性多肽常以非活性状态存在于蛋白质中，这些蛋白质经过蛋白酶的水解作用，使隐藏于其中的活性肽释放出来，有可能发挥出比蛋白更多的生物活性[2-4]。当今社会，人们受肿瘤的严重危害，寻找低毒、高效的抗肿瘤药物迫在眉睫。而海洋物质丰富，近年来有报道海洋天然活性成分具有一定的抗肿瘤活性[5,6]。本文以新鲜的泥螺软体组织为对象，提取分离了不同分子量的泥螺活性多肽，并对分子量在5~10 kDa的组分进行体外抗肿瘤活性的初步研究，为抗肿瘤药物的研发提供参考。
2. 材料与仪器
2.1. 材料
泥螺，购于舟山南珍菜场。胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司)；葡聚糖凝胶G-75(Pharmacia)；其余试剂均为分析纯。
2.2. 主要仪器
BSA124S型电子天平(德国，Sartorius AG公司)；DS-1型高速组织捣碎机(上海标本模型厂)；高速冷冻离心机CF16RXII(日立HITACHI公司)；TG16-WS台式高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；SHB-III A循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；旋转蒸发器RE-2000(上海亚荣生化仪器厂)；U2800型紫外可见分光光度计(日本，HITACHI公司)；自动部分收集器(BSZ-40-LCD)；HWS26型微电脑电热恒温槽(上海一恒科技有限公司，上海一恒科学仪器有限公司)；Spectrum 752 p紫外可见分光光度计(上海恒平科学仪器有限公司)；MSC300超滤杯(超滤膜：5 kDa和10 kDa)(上海摩速科学器材有限公司)；LGJ-18冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；QT-58A智能紫外检测仪(上海琪特分析仪器有限公司)；QT-199FC-LCD智能自动部分收集器(上海琪特分析仪器有限公司)。
3. 方法
3.1. 酶解
泥螺去壳，取其软体采用组织捣碎技术捣碎，于–20℃冷藏备用。取上述经捣碎的泥螺软体组织用胰蛋白酶酶解，选用最佳酶解条件[5]，即酶解温度45℃，pH 8.7，料液比1:4，酶解时间8 h，加酶量0.48%。经灭酶后，在转速8500 rpm左右，温度为4℃条件下离心25 min，弃去滤渣。
3.2. 酶解产物膜分离
取上述澄清液，使用超滤杯及截取分子量分别为5 kDa和10 kDa的超滤膜，截取后分别获得分子量为5~10 kDa的酶解液，旋转蒸发，冷冻干燥获得固体粉末。
3.3. 葡聚糖凝胶层析分离
Sephadex G-75用4℃蒸馏水溶胀12 h，装入2.6 cm × 100 cm层析柱。取备用的冻干样品用3 mL去离子水溶解(0.1 g·mL–1)后，0.22 μm微孔滤膜过滤，上柱。用超纯水平衡、洗脱，流速1.5 mL·min–1，每2 min收集1管，即每1收集管为3 mL的流出液，分别将各收集管的流出液在波长280 nm处测定吸收值。收集洗脱峰，浓缩冻干备用。
3.4. 细胞培养
选取人前列腺癌细胞PC-3(原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存)，用含10%胎牛血清的F12完全培养基于37℃，5% CO2的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，0.25%的胰蛋白酶消化，每2~3天传代1次，实验时选用对数生长期细胞。
3.5. 细胞增殖抑制率的测定
采用MTT法检测。取对数生长期的前列腺癌PC-3细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200 μL，置5% CO2，37℃培养箱中分别培养24 h，然后分别加入不同浓度泥螺多肽溶液，每个浓度设3个平行孔，同时设不加药对照组，置5% CO2，37℃培养箱中孵育24 h、48 h、72 h。培养结束后，加PBS溶液(pH 7.2)清洗3次，再加MTT继续培养4 h，吸弃MTT，加二甲基亚砜每孔150 μL，置酶联免疫检测仪在490 nm测吸光度，计算细胞增殖抑制指数(IR)[7]。计算公式如下：
3.6. 细胞凋亡的形态学分析
取处于指数生长期的PC-3细胞，加入适量0.25%胰酶消化，用含10%进口小牛血清的1640培养液配成悬液，用血球细胞板计数，配成2 × 105·mL–1，取放有盖玻片的6孔细胞培养板，每孔加细胞悬液3 mL，将细胞板放在37℃，含5% CO2的培养箱中分别孵育24 h后取出。将每组药液分别加入各孔中，再将细胞板放在37℃，含5% CO2的培养箱中分别孵育24 h后取出细胞培养板。取出载玻片，加1滴混合荧光染色液：100 μg·mL–1吖啶橙(AO)和100 μg·mL–1嗅乙啶(EB)混匀，压上爬满细胞的盖玻片，荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。
4. 结果与分析
4.1. 葡聚糖凝胶G-75分离峰图
酶解后的泥螺多肽混合物，经超滤膜分离，获得不同分子量的粗提物。选取分子量为5~10 kDa的酶解液，经葡聚糖凝胶G-75柱层析分离，在280 nm紫外分光光度计检测下，测定其吸收峰如图1所示。结果表明，第15管~19管的流出液出现1个吸收峰，第42管~58管的流出液又出现1个吸收峰，葡聚糖凝胶洗脱得到的两个峰分离较好，记为峰1、峰2。由于本实验室前期的研究中，已通过正交法得到了泥螺活性肽的最佳酶解条件，并且已对3 kDa组分进行了初步的抗癌活性研究[8]。因此本实验在此基础上采用G75葡聚糖凝胶对5~10 kDa多肽产物进行分离、纯化，并测定其体外抗肿瘤活性。
4.2. 细胞增殖抑制率的测定
按照2.5方法所示观察对PC-3细胞株的增殖抑制作用。实验结果表明，5~10 kDa组分和峰2对前列腺PC-3癌细胞都有一定的抑制作用，并且随着浓度的增加和时间的推移其抑制作用逐渐加强。峰2浓度为30 mg·mL–1时，对前列腺PC-3癌细胞抑制效果较明显。然而当峰2浓度为20 mg·mL–1时，虽有抑制效果但其抑制效果明显低于30 mg·mL–1时的抑制作用，也比5~10 kDa组分的抑制效果差(表1和图2)。
4.3. 细胞凋亡的形态学分析
图3正常PC-3细胞，核染色质呈均匀黄绿色，AO/EB染色 × 400。
图4浓度为20 mg·mL–1的泥螺多肽作用于PC-3细胞24 h，晚期凋亡细胞较多，核染色质固缩，呈桔红色。但有部分细胞属于早期凋亡，细胞膜完整，核染色质固缩，呈现黄绿色，AO/EB染色 × 400。
图5浓度为30 mg·mL–1的泥螺多肽作用于PC-3细胞24 h，随着浓度的增加，细胞死亡增多，且核染色质固缩，呈均匀一桔红色，AO/EB染色 × 400。
泥螺多肽作用PC-3细胞24 h后，细胞经AO、EB双染色，在荧光显微镜下可见4种细胞。活细胞：
Figure 1. Sephadex G-75 gel chromatography of the Bullacta peptides (5~10 kDa)
图1. 泥螺多肽5~10 kDa组分葡聚糖凝胶G-75峰图
Table 1. Inhibition rate of Bullacta peptides on PC-3 cells
表1. 泥螺多肽5-kDa组分和峰2对前列腺PC3癌细胞的抑制率
Figure 2. Effects of Bullacta peptides on the proliferation of PC-3 cells
图2. 泥螺多肽5~10 kDa组分和峰2对前列腺PC3癌细胞的抑制率与时间关系
Figure 3. Normal cells with EB/OB staining
图3. 正常细胞AO/EB双染荧光显微镜观察图
Figure 4. Low concentration of Bullacta peptides with EB/OB staining
图4. 低浓度多肽作用下AO/EB双染荧光显微镜观察图
Figure 5. High concentration of Bullacta peptides with EB/OB staining
图5. 高浓度多肽作用下AO/EB双染荧光显微镜观察图
核染色质呈均匀黄绿色；早期晚期凋亡细胞：细胞数较少，细胞膜完整，但核染色质固缩，呈黄绿色荧光；晚期凋亡细胞：核染色质固缩，呈桔红色；死亡细胞：细胞染成均一桔红色。并且随着泥螺多肽剂量的增加，晚期凋亡和死亡细胞逐渐增多，晚期凋亡细胞核浓聚，被染成桔红色，而死亡细胞被染成均一的桔红色。
5. 小结
本实验结果提示，采用胰蛋白酶酶解泥螺软体组织，并经超滤膜分离得到分子量为5-10kDa的粗提物，进一步通过G75葡聚糖凝胶柱层析分离，所得到的多肽产物对前列腺PC-3细胞具有一定的抗肿瘤活性。其抗肿瘤活性多肽的进一步分离纯化以及作用机制还有待于深入研究。
参考文献 (References)
[1] 李晔, 苏秀榕, 李太武. 泥螺抗菌肽的初步研究[J]. 台湾海峡, 2005, 2(24): 145-149.
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[4] F. Guerard, L. Dufosse, D. L. Broise, et al. Enzymatic hydrolysis of proteins from yellow fintuna (Thunnus albacares) wastes using Alcalase. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, 11(4-6): 1051-1059.
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[8] 胡俊锋, 胡志龙, 徐律, 叶俏, 尹伊, 马剑茵. 泥螺多肽酶解工艺的研究[J]. 健康必读杂志, 2011, 4(4): 337-339.
NOTES
*通讯作者。