ABSTRACT

Object: To establish free amino acid fingerprint of human serum. Method: The free amino acid of serum from the healthy persons was determined by the L-8900 automatic amino acid analyzer, and 15 major characteristic peaks of fingerprint were chosen as the common peak. Result: Free amino acid fingerprint of 12 batches of human serum was established. Conclusion: The fingerprint has preferably precision, repeatability and stability; it can be used as the theoretical basis of free amino acid fingerprint database of human serum.

Keywords:Human Serum, Free Amino Acid, Fingerprint

人血清中游离氨基酸指纹图谱的初步研究

徐慧，陈秋虹，黄岛平，苏梅清

广西分析测试研究中心，广西 南宁

收稿日期：2016年12月28日；录用日期：2017年2月5日；发布日期：2017年2月8日

摘 要

目的：建立人血清中游离氨基酸的指纹图谱。方法：采用L-8900全自动氨基酸分析仪测定健康人群血清中的游离氨基酸，选择15个主要特征峰为指纹图谱共有峰。结果：建立了12批人血清样品的游离氨基酸指纹图谱。结论：建立的指纹图谱有较好的精密度、重复性和稳定性，可作为人血清游离氨基酸指纹图谱库的理论基础。

关键词 :人血清，游离氨基酸，指纹图谱

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1. 引言

近年来，人们已逐渐认识到血液中氨基酸水平与身体各项机能的关系，且有大量的医学研究表明，氨基酸含量的改变影响人体的生理功能并产生某些疾病，而某些疾病又影响氨基酸的代谢而使氨基酸含量发生改变，因此人血清中的氨基酸含量不再单纯的被当做评价营养状态的指标，而是被当做评价病理状态的指标来看待。不少研究都表明遗传代谢病的发生是由氨基酸代谢异常引起，人血清中游离氨基酸含量检测分析已经成为遗传代谢病筛查与诊断的主要技术。氨基酸代谢与人的健康和疾病状态有直接关系。

2. 材料与方法

2.1. 样品来源

中国疾病预防控制中心营养与食品安全所提供，具体见表1。

2.2. 主要试剂及仪器

磺基水杨酸(分析纯)

氨基酸混合标准(日立)

漩涡振荡器

高速冷冻离心机

L-8900日立全自动氨基酸分析仪

表1. 样品表

3. 实验方法

3.1. 样本采集与处理

将储存于−80℃的冷冻血液解冻，3000转/min离心10 min，取上清液，然后15,000转/min离心10 min，吸取500 μL上清液(血清)加8%磺基水杨酸500 μL于离心管中混匀，置漩涡振荡器上漩涡2 min，15,000转/min离心20 min，取上清液用0.45 µm滤膜过滤，备用上机。

3.2. 色谱条件

分析柱是Li型离子交换色谱柱(4.6 mm × 60 nm，3 µm) (填料为磺酸型阳离子树脂)，流动性为锂盐缓冲液，双通道检测，流速分别是0.45 mL/min、0.35 mL/min，检测波长分别是420 nm、570 nm，分离柱柱温 57 ℃ ，柱后衍生，衍生剂为茚三酮反应液，反应柱温度为 135 ℃ 。将混合标准液稀释至25 nmol/mL，标准液和供试液进样量均为20 µL，色谱记录时间为120分钟。氨基酸色谱图见图1和图2。

4. 方法学考察

4.1. 共有峰的确定

在120分钟内选择峰面积较高的15个主要特征峰为共有峰。通过与对照品图谱比对，其中保留时间为50.73分钟的10号峰Leu峰作为参比峰(表2)。

4.2. 精密度考察

精密吸取供试品溶液20 µL，连续进样6次，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度计算，色谱指纹图谱的相似度均大于0.980，表明该仪器的精密度良好。

图1. 氨基酸标准图谱

图2. 人血清游离氨基酸图谱

表2. 共有峰信息

4.3. 稳定性考察

设置样品盘温度为 4 ℃， 取同一份供试品溶液在0、1、1.5、2、5、10 h分别测定，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于0.980，供试品溶液的成分在72小时内是稳定的。

4.4. 重复性

同一批样品取样5份，按3.1项下操作，依3.2条件检测定，6份供试品溶液测得的色谱指纹图谱的全貌直观观察无明显变化，用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于0.980，该方法的重复性较好。

4.5. 样品指纹图谱检测

取样品12批次，按3.1项下操作，依3.2条件检测定，得出12批样品游离氨基酸图谱，对应的保留时间和峰面积见表3和表4。

5. 结果

指纹图谱相似度计算：按检测方法进行测定，得出12批样品的游离氨基酸图谱，用12批次样品图谱分别与样品0321对比，采用中药材指纹图谱相似度评价软件，12批样品指纹游离氨基酸图谱匹配后的图谱见图3，根据公式计算夹角余弦和相关系数，结果见表5。

表3. 12批人血清游离氨基酸指纹色谱图共有峰保留时间

图3. 游离氨基酸指纹图谱匹配图

表4. 12批人血清游离氨基酸指纹色谱图共有峰的峰面积

表5. 12批样品游离氨基酸指纹图谱相似度比较

相似度评价：以8号样品为参照，1、2、7、11号样品游离氨基酸指纹图谱相似度较好，相似度均大于0.960。

人血清氨基酸含量分析，结果见表6。

6. 讨论

本文选用人血中的游离氨基酸来研究氨基酸指纹图谱，较之常规的18种氨基酸分析程序，采用氨基酸生理体液测定系统测定人血中的游离氨基酸的含量，分析时间较长(120 min)，分析氨基酸的种类更多，除组成天然蛋白质基本结构的20种氨基酸外，还可分析很多特殊的其他氨基酸，这些特殊氨基酸都是20种基本氨基酸中某种氨基酸的衍生物，都是在其母体氨基酸参入多肽链后经酶促修饰生产的，此类氨基酸都是某些特种蛋白质的成分。这些氨基酸的功能和作用有些已明确，有些尚在研究中。研究表明，氨基酸代谢与人的健康和疾病状态有直接关系，氨基酸的失衡会导致机体各种生理病理学改变。肿瘤患者多数为高代谢状态，体内蛋白质合成及分解代谢均增高，产生的代谢产物及血液中各种物质成分也随之改变。而作为蛋白质合成的原料及分解代谢产物，氨基酸成分及浓度改变也往往反应了肿瘤患者的不同状态。癌肿快速生长和癌细胞无限制增殖需要大量的营养底物，特别是氨基酸会被大量摄取并消耗，这必然会引起癌组织氨基酸代谢库的改变 [1] 。各种疾病是否对氨基酸代谢不同，这有待于进一步的研究证实。从本文的研究结果表明，用L-8900氨基酸分析仪建立的人血中游离氨基酸指纹图谱有较好的精密度、重复性和稳定性。根据本文的分析结果，虽然可以初步确定人血中氨基酸的指纹图谱，但是由于样品有限，尚难以证明本方法的有效性和代表性。本研究需要建立大量样品基础，才具有统计学意义。今后仍要通过收集多样具有代表性的样本，开展氨基酸指纹研究，经严谨细致的数据统计分析，从中得出规律和差异，才能确立人血中游离氨基酸的可靠稳定指纹图谱库。

表6. 12批人血清氨基酸定量分析结果(单位: μmol/L)

基金项目

广西分析测试研究中心2012年公益性科研院所基本业务费项目(2012ACZ02)。

文章引用

徐 慧,陈秋虹,黄岛平,苏梅清. 人血清中游离氨基酸指纹图谱的初步研究
A Preliminary Study on Free Amino Acid Fingerprint of Human Serum[J]. 分析化学进展, 2017, 07(01): 1-8. http://dx.doi.org/10.12677/AAC.2017.71001

参考文献 (References)