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1. 引言

尿素在健康人口腔环境中的平均浓度一般是3~10 mmol∙L⁻¹，可以持续地从唾液和龈沟液中分泌出来，被口腔细菌产生的尿素酶快速水解，生成CO₂和NH₃^[1]。NH₃ 在溶于水后，会产生碱性物质，从而中和口腔中葡萄糖酵解产生的酸，升高口腔环境中的pH值^[2]。尿素酶是一种存在于多种原核和真核生物中的金属结合酶^[3]，口腔内具有尿素酶活性，能分解尿素的细菌有唾液链球菌、内氏放线菌、幽门螺杆菌(Hp)等多种细菌^[1]。由于尿素的分解作用对口腔环境中微生物致病机制具有的重要影响^[4]，与口腔疾病与健康以及龋病的发生、预防等均密切相关^[5,6]，且尿素酶及其抗体的检测可用于相关细菌感染的诊断，并已日益受到人们的关注。现将近年来报道的口腔细菌尿素酶的检测方法，以及Hp尿素酶抗原检测法综述如下。

2. 口腔细菌尿素酶的检测

口腔细菌尿素酶的检测，可以采用经典的pH指示剂法、纳氏试剂显色法、免疫学方法和聚合酶链反应(PCR)检测尿素酶基因法等。

2.1. pH指示剂法

能方便地检测出液态或固态环境中的酸碱pH值变化，是一种定性检测尿素酶活性的实验方法^[7]。酚红指示剂的变色范围是6.8~8.4，变色点是7.81，故当溶液中的pH值高于变色点时即呈现红色，当溶液中的pH值低于变色点时即呈现黄色。细菌所产生的尿素酶具有分解尿素产生NH₃的活性，从而使含有酚红指示剂的试纸变成碱性而显现红色。内镜下胃黏膜快速尿素酶试验(RUT)就是据此原理通过颜色的改变判断有无Hp感染存在。但由于口腔内多种细菌都具有尿素酶活性，故RUT用于口腔内Hp检测则缺乏特异性。

2.2. 纳氏试剂显色法

尿素酶分解尿素后生成NH₃，NH₃可与纳氏试剂发生作用，生成棕黄色的碘化双汞铵，从而可以定性地观测到尿素的分解情况^[8]。该方法采用化学分析原理，检测细菌所产生的尿素酶分解尿素后的最终产物NH₃，其阳性显色反应不是取决于试剂中pH的改变，故可以避免一些影响pH的因素所导致的假阳性结果。但用于口腔内Hp检测则同RUT一样缺乏特异性。

2.3. 唾液尿素酶抗体检测

细菌尿素酶可刺激宿主产生免疫反应，生成IgG、IgA、IgM抗体，传统的血清学试验主要是检测可长期在于血清中的IgG抗体。常用的方法主要有胶乳凝集试验法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫酶试验、免疫印迹技术等。唾液、尿液等分泌物抗体检测方法，取样简便，其敏感度、特异度与血清学试验相似。唾液尿素酶抗体检测，是用结合在胶乳颗粒或胶体金上的尿素酶抗原检测样本中的尿素酶抗体，利用抗原抗体之间的特异性结合，出现肉眼可见的凝集反应，对尿素酶进行定性检测^[9]。其特异性则取决于尿素酶抗原，如采CagA阳性Hp尿素酶抗原，则可特异性的检测样本中的CagA阳性Hp尿素酶抗体。由于抗Hp-IgG在Hp根除治疗后6~8个月内仍可持续阳性，故无法区分现症感染或既往感染，抗Hp-IgG阳性提示存在Hp感染，但无法提示Hp感染的部位。

2.4. 唾液尿素酶抗原检测

尿素酶抗原检测法的研究临床上尚鲜见报道。2006年俞莹莹等^[10]应用唾液Hp抗原ELISA检测法检测Hp，是采用免疫Hp多克隆抗体检测唾液中Hp抗原。2009年叶国钦^[11]应用唾液Hp尿素酶抗原检测法检测Hp，是采用免疫CagA阳性Hp尿素酶单克隆抗体检测唾液中CagA阳性Hp尿素酶抗原，下节将作详细介绍。

2.5. 聚合酶链反应(PCR)

由于尿素酶普遍存在于口腔内具有尿素分解活性的细菌中，故可以设计合适的引物，通过PCR^[12]或者实时定量PCR^[13]扩增定性检测标本中有无尿素酶的存在，並进行定量检测。随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)法及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)法试验是在PCR试验技术基础上发展起来的两种方法^[9]。RAPD法是以人工合成的寡核苷酸片段做随机引物，以纯培养的细菌基因组DNA做模板，通过PCR反应进行多态性片段的随机合成^[14]。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，采用RFLP法同样可以对细菌进行基因的分型研究^[15,16]。荧光原位杂交是一种运用非放射性原位杂交技术的检测方法，通过DNA与携带报告分子(如生物素、地高辛等)的核酸探针之间的同源互补而形成杂交体，利用报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测细菌的DNA进行分析^[16]。PCR法是检测Hp很敏感的技术，特异性强，并且对标本要求较低，适用于标本中Hp含量过少，或因含大量正常菌群而降低Hp培养敏感性时Hp的检测，对牙菌斑、舌背部与牙周病变黏膜刮取物、唾液、龈沟液中的Hp DNA均可进行检测。但因受引物的影响，容易产生假阴性；亦因PCR对与Hp密切相关的细菌群，可由于交叉反应而出现假阳性。PCR技术的关键是引物的特异性，为了增加PCR的特异性，必须使用两种不同的引物。目前PCR法检测是依据Hp特异的尿素酶C和CagA基因来设计引物的。

3. 唾液Hp抗原检测技术

唾液Hp抗原检测技术，是一种免疫显色的图解化验法。通过应用胶体金层析式双抗体夹心法原理，采用纯化的CagA阳性Hp尿素酶单克隆抗体，定性检测人体唾液中相应Hp产生的尿素酶，从而诊断Hp感染性疾病。唾液Hp抗原测试板，简称HPS测试板，是一种用于检测口腔中CagA阳性Hp尿素酶的新方法^[11]。

3.1. HPS的检测流程

如受检者的唾液中含有Hp产生的尿素酶，此尿素酶伴随唾液流至胶体金乳胶试纸时，尿素酶可与试纸中的胶体金标记物结合，当此尿素酶与胶体金的结合物继续流至检测带时，此结合物又可与检测带中的尿素酶单克隆抗体(Hp鼠抗体)再次结合，并被截留而聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记，直接观察到一条紫红色线(T线)，即为阳性。如受检者的唾液中无Hp产生的尿素酶，检测带上就无尿素酶胶体金结合物与尿素酶单克隆抗体结合的沉淀物被截留，就不会出现紫红色线，即为阴性。未与唾液中Hp尿素酶结合的游离胶体金标记物，则可伴随唾液越过检测带，移动至对照带时与对照带中的羊尿素酶多克隆抗体(羊对鼠抗体)结合，并显示出红色的对照线(C线)。见图1。

3.2. HPS的敏感度

HPS是利用纯化的CagA阳性Hp尿素酶单克隆抗体，特异性地识别口腔相应Hp感染时存在于唾液中的尿素酶，其灵敏度达到10 ng/ml，即用于检测的唾液中存在数个Hp产生的尿素酶，就可在15 min左右显示出阳性结果，表明HPS具有较高的敏感度。在实验室中HPS的最低灵敏度，是通过测定Hp尿素酶浓度间接取得的。尿素酶是Hp释放的一种蛋白质，

图1. HPS检测流程示意图：1) 吸样本纸；2) 胶体金乳胶纸；3) T线(检测线——Hp鼠抗体)；4) 玻璃纤维膜；5) C线(对照线——羊对鼠抗体)；6) 吸水纸；7) 唾液流向

在实验室中测定其浓度是应用牛血淸蛋白技术(BSP)，同时通过光透射方法，把同一等级的蛋白质分子大小作为刻度去测定尿素酶的浓度，再在这个尿素酶浓度的刻度下去测定HPS的最低灵敏度。

3.3. HPS的特异度

在口腔中很多细菌都可产生尿素酶，如变形杆菌属(Proteus)、克雷伯菌属(Klebsiella)、牙孢杆菌属(Bacillas)、埃希氏菌属(Escherichia)和螺杆菌属(Helicobacter)等。虽然各种细菌产生的尿素酶都是由α、β亚单位组成，但不同细菌产生的尿素酶，其空间构象各不相同，而且除Hp之外，各种细菌的尿素酶，均位于细胞质中，只有Hp的尿素酶，位于细胞膜上或细胞膜外^[3]，所以可应用针对CagA阳性Hp尿素酶的单克隆抗体特异性地检测口腔中相应Hp产生的尿素酶，而不受其它因素的影响。细菌实验室的检测结果亦显示：可能存在于口腔中的细菌产生的尿素酶与Hp产生的尿素酶，均不存在交叉反应^[11]。表明HPS具有较高的特异度。

3.4. HPS测试板的使用方法

将受检者的唾液收集在标本杯中，用吸管吸取4滴唾液滴入取样杯中，再滴入2滴缓冲液；更换吸管并充分混匀后，吸取3~4滴混合液，滴入测试板的“吸样窗口”中，15 min左右观察结果。如指示窗口中显示T线和C线，说明HPS检测结果呈阳性；如指示窗口中只显示C线未显示T线，说明HPS检测结果呈阴性；如指示窗口T线和C线均未显示，表示检测失败，可更换测试板后再次进行检测。最近投入临床使用的唾液Hp抗原测试笔(HPS测试笔)，是HPS测试板的改进型，只需将试笔像口腔用体温表一样放置舌下，即可自动采集唾液标本进行检测，使用更为简便。检测时的注意事项为在测试前1小时内不能刷牙、漱口、进食和饮水。

3.5. HPS的临床研究

2009年叶国钦^[17]首次发表了“唾液幽门螺杆菌抗原检测法(HPS)的临床应用评价”。此后有关HPS与UBT、RUT、Hp联合检测(包括胃黏膜Hp培养、组织学检查、RUT、UBT)的对比研究结果相继在医学期刊上发表^[18-21]，运用HPS法检测唾液中Hp抗原的结果表明，唾液中存在高Hp检出率现象(各组阳性率分别为77.19%，88/114；47.50%，38/80；87.65%，142/162；43.33%，65/150)。但以UBT、RUT或Hp联合检测标准为对照，HPS的敏感度为72.55%~98.55%，特异度为27.78%~96.55%，准确度为50.39%~95.06%，阳性预测值为39.80%~97.37%，阴性预测值为57.69%~ 92.94%。目前研究HPS的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值均是以UBT、RUT或联合检测标准为对照取得的结果。虽然HPS与UBT、RUT都是依赖于Hp产生的尿素酶来检测Hp，但HPS是采用纯化的CagA阳性Hp尿素酶单克隆抗体，去跟踪唾液中相应的Hp产生的尿素酶，因此HPS检出的阳性结果主要显示患者口腔中存在CagA阳性Hp尿素酶。UBT是胃内Hp产生的尿素酶，将口服入胃的¹³C或¹⁴C尿素分解成NH₃和¹³CO₂或¹⁴CO₂，通过测定呼气中¹³CO₂或¹⁴CO₂的量来判断胃内是否存在Hp。胃黏膜RUT是Hp产生的尿素酶，可将内源性尿素分解成NH₃和CO₂，NH₃的产生可使胃黏膜pH值升高，通过加入pH指示剂试纸颜色的改变来判断有无Hp感染。因此，UBT与RUT检测出的阳性结果，主要显示患者胃内存在Hp尿素酶。因此，HPS与UBT、RUT、Hp联合检测之间缺乏可比性，致使以UBT、RUT或Hp联合检测标准为对照，得出的HPS敏感度、特异度和准确度的结果不稳定。但因为胃Hp感染者合并口腔Hp感染的机率甚高，这又使在同步进行HPS与UBT、RUT、Hp联合检测时表现出较好的相关性。

最近我们应用¹³C-UBT、HPS、HPF (唾液幽门螺杆菌鞭毛抗原测试板)、血清Hp-IgG、粪鞭毛抗原同步检测的方法，对一组91例健康体检者进行检测。另一组110例有上消化道症状患者在检测HPS、HPF同期检测¹³C-UBT、血清Hp-IgG、内镜下胃黏膜RUT、切片染色镜检、Hp培养。两组临床试验的结果显示：1) HPS与HPF比较，2组差异均无统计学意义；¹³C-UBT阳性组HPS、HPF与血Hp-IgG，¹³C-UBT阴性组HPS、HPF与血Hp-IgG比较，2组差异也均无统计学意义(均P > 0.05)。依据HPS、HPF检测的阳性结果可判断为口腔Hp感染。2) 粪Hp鞭毛抗原与¹³C-UBT，RUT、切片染色镜检、Hp培养与¹³C-UBT检测结果比较差异均无统计学意义；¹³C-UBT阳性组的粪Hp鞭毛抗原与血清Hp-IgG，RUT、切片染色镜检、Hp培养与血清Hp-IgG检测结果比较差异也均无统计学意义(均P > 0.05)；¹³C-UBT阴性组的粪Hp鞭毛抗原与血清Hp-IgG，RUT、切片染色镜检、Hp培养与血清Hp-IgG 检测结果比较差异均有统计学意义(均P < 0.05)。依据¹³C-UBT、RUT、切片染色、Hp培养、粪Hp鞭毛抗原检测的阳性结果可以判断为胃内Hp感染。3) HPS、HPF与¹³C-UBT检测结果，2组差异均有统计学意义(均P < 0.05)，提示¹³C-UBT检测不能正确判断口腔Hp感染^[22]。

4. 胃Hp感染与口腔Hp感染的相关性

胃内Hp与口腔中Hp的关系学术界一直存在争议，争议的焦点是在口腔中发现的Hp，是单纯由于含有Hp的胃液反流入口腔，引起一过性在口腔中出现Hp；还是通过口–口、粪–口、胃–口传播进入口腔的Hp，定植于牙菌斑或牙周组织中所致。伦敦大学医学院Allaker等^[23]检查了100名儿童，采用内镜下取胃黏膜进行RUT、细菌培养法来诊断胃Hp感染，从阳性患者的口腔牙菌斑中用PCR检测Hp，结果发现68%的患儿胃Hp阳性者，其牙菌斑有Hp存在，同时在胃Hp阴性的儿童中，也有24%可以在牙菌斑中找到Hp。张晶等^[21]检查了150名儿童，采用内镜下取胃黏膜进行RUT法检测胃Hp感染，HPS法检测口腔Hp感染，结果发现27.33%(41/150)RUT阳性，43.33%(65/150)HPS阳性，41例RUT阳性者中HPS阳性35例，占85.37%，109例RUT阴性者中HPS阳性30例，占27.52%。近年来Eskandari等^[24]采用PCR法，在无胃Hp感染者的牙菌斑中检测到Hp。以上发现说明人类口腔环境也适宜于Hp聚集和定植。

口腔存在Hp对胃Hp根除率的影响，Miyabayashi等^[25] 研究47例Hp阳性胃病患者，根除Hp治疗后，用巢式PCR检测唾液中Hp-DNA，结果发现，唾液中Hp阳性的患者其根除率(12/23，52.1%)明显低于唾液中Hp阴性患者(22/24，91.6%) (P < 0.05)；随访2年，唾液中Hp阳性患者胃病缓解率69.5%，阴性患者缓解率95.8% (P < 0.05)。侯海玲等^[26]对102例有上消化道症状，并经全口牙周检查有不同程度牙周炎的患者进行胃镜检查，每例均取口腔标本用PCR法进行Hp检测，对胃Hp阳性患者经药物治疗后4周进行复查，其中口腔Hp阳性者的胃Hp根除率(64.0%，16/25)低于口腔Hp阴性者 (72.7%，24/33)；治疗后1年，口腔Hp阳性者的胃Hp根除率(36.0%，9/25)与口腔Hp阴性者的根除率(63.6%，21/33)相比差异有统计学意义(P < 0.05)。高静等^[27]对58例有胃Hp感染患者进行PPI三联疗法治疗前后用PCR法进行了口腔中的Hp检测，结果发现治疗前口腔Hp阳性者在治疗后4周复查胃Hp根除率，稍低于治疗前口腔Hp阴性者(68.0%比69%)；治疗1年后，前者的胃Hp根除率更是显著低于后者(32.0%比66.0%，P < 0.05)。叶国钦等^[18] 采用HPS与¹³C或¹⁴C-UBT同步检测的方法，对129例经胃镜检查证实Hp阳性，采用标准三联疗法根除治疗后4周进行复查，HPS法检测阳性率为75.97%，UBT阳性率为34.11%。Gzesnikiewicz-Guzik等^[28]发现上消化道疾病患者经Hp治疗后，Hp已在胃内根除，却仍然存在于口腔中。以上报道显示，口腔Hp感染可影响Hp根除方案的治疗效果，尤其是远期疗效。由于口腔中的Hp存在于牙菌斑、龈袋、唾液中，特别是牙菌斑微生物具有独特的“生物膜”(biofilm)结构，Hp能借此逃避抗生素的杀灭，故全身用药对其作用甚微。根除治疗后仍存留在口腔中的Hp，可随唾液不断吞咽入胃，并可再次在胃内定植，能导致临床观察到的胃Hp复发或再感染。口腔内Hp不仅是Hp根除治疗失败的重要原因，而且作为Hp另一主要储存地，牙菌斑中的细菌可能是Hp重要的传染源，口–口传播可能是Hp播散最重要的途径。清除口腔中的Hp对提高Hp根除率，减少Hp的传播都具有重要意义。

5. HPS与UBT、RUT联合检测的临床意义

Hp能否定植于口腔中,是国际医学界至今仍存在争议的一大问题^[29]。由于缺乏实用的口腔Hp检测技术，致使定植在口腔中的Hp一直难以被确认。HPS的临床应用不仅使口腔Hp是否存在的争议带到了终点，它还提示了一个前瞻性的思路，“口源性Hp”的存在是胃内Hp无法根除的主要原因，只有正视“口源性Hp”的存在，从口腔中找到Hp诊治的突破口，才能有效地根除胃内Hp。

HPS是近年研制成功并主要用于口腔Hp检测方法，UBT是传统的主要用于胃Hp感染的非侵入性检测方法，RUT已成为侵入性Hp检测方法的首选。目前基层医院胃Hp感染的检测，仍以内镜下胃黏膜RUT为主要方法，为查明口腔Hp感染情况，并避免内镜检查完毕退出时胃内Hp带入口腔影响HPS的检测结果，因此HPS检测需在内镜检查之前先进行，以查明口腔Hp感染情况。两种检验方法同步检测结果可以显示：1) HPS阳性、UBT或RUT阳性，提示口腔和胃都存在Hp感染；2) HPS阳性、UBT或RUT阴性，提示单纯口腔Hp感染；3) HPS阴性、UBT或RUT阳性，提示单纯胃Hp感染；4) HPS阴性、UBT或RUT阴性，提示未受Hp感染。根据以上检测结果，临床医师就可以为胃合并口腔Hp感染者、单纯口腔Hp感染者或单纯胃Hp感染者，制定出更为个体化的Hp根除治疗方案。处理口腔中Hp感染是一个新的课题，比治疗单纯胃内Hp感染要复杂得多。高文等^[30]观察含呋喃唑酮的四联疗法联合口腔洁治进行补救治疗对Hp根除多次失败患者的疗效，联合口腔洁治的四联疗法组与单纯四联疗法组比较，可提高Hp根除率13.4%(85.9%比72.5%，P = 0.091)。口腔洁治，虽可暂时清除Hp在口腔中的孳生地，但不能杀灭口腔中Hp。叶国钦等^[11,31-34]报道多聚赖氨酸复合体(L-GML)治疗口腔Hp感染的疗效观察中，对150例经唾液HPS检测2次均呈阳性的口腔Hp感染者，随机分为治疗组105例，使用以L-GML配置的漱口液和口腔喷雾剂喷射在牙齿与口腔黏膜上，每日2次，疗程2个月；对照组45例，不用任何治疗。结果：治疗组105例于治疗结束后2周复查，经2次HPS检测结果，其中86例(81.91%)转阴；对照组45例，与治疗组复查的同时检测2次HPS，结果无1例转阴，两组比较差异有统计学意义(x² = 86.38，P < 0.05)，提示L-GML对杀灭口腔中Hp有效。

目前多数学者认为耐药是Hp根除失败的主要原因，但Hp在口腔内定植，亦应是Hp根除治疗失败另一重要原因。我深信随着Hp研究工作的不断深入，应用于口腔Hp检测的HPS法在临床上逐步推广使用，口腔Hp感染的神秘面纱会被进一步揭开，这一观点终将会得到广大学者和医务工作者所认同。现有的标准PPI三联疗法、经典含铋剂的四联疗法等Hp根除治疗方案，仅仅局限于胃内Hp感染的治疗，它没有涉及到处理口腔Hp感染。因此，除了必须定期监测Hp的耐药率，筛选敏感的抗生素外，诊治口腔中Hp应是提高Hp根除率的关键。Hp根除治为一项系统工程，消化科与口腔科之间应构筑起一座桥梁，两个学科需共同做出努力，才有可能最终提高Hp根除率。

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