Botanical Research
Vol.1 No.2(2012), Article ID:812,3 pages DOI:10.4236/br.2012.12002
Calcineurin B-Like Proteins and Their Interacting Protein Kinases
College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou
Email: jianglx@zju.edu.cn
Received: May 9th, 2012; revised: May 20th, 2012; accepted: Jun. 10th, 2012
ABSTRACT：
Calcium is a critical messenger in several biological processes. Cellular calcium signals are detected and transmitted by Ca2+ sensor such as calcium-binding proteins. Calcineurin B-Like protein (CBL) family represents a group of such calcium sensors and plays a key role in decoding calcium signals by specifically interacting with and regulating a family of protein kinases CIPKs (for CBL-interacting protein kinases). Many researches have revealed that several CBL proteins and CIPKs are important components of abiotic stress responses and ion transport processes. Here, we discuss structures and functions of CBLs and CIPKs and how specific Ca2+ signal responds are realized.
Keywords: CBL; CIPK
类钙调神经磷酸酶B亚基蛋白CBL和它们的作用激酶蛋白CIPK
沈 清，郭万里，蒋立希
浙江大学农业生物技术学院，杭州
Email: jianglx@zju.edu.cn
摘 要：
Ca2+作为第二信使介导大量的信号传递，在许多生命过程中发挥重要的作用。Ca2+信号通过Ca2+感受器即Ca2+结合蛋白来解码并传递。类钙调磷酸酶B蛋白CBL(Calcineurin B-Like Protein)便是其中一类Ca2+结合蛋白。通过与其特定的激酶蛋白CIPK(CBL-Interacting Protein Kinase)作用，在Ca2+信号传导通路，尤其是一些逆境信号传导通路中发挥重要作用。本文主要围绕CBL和它们的作用蛋白CIPK，在其结构、功能以及它们如何对信号做出不同反应的机制上对一些已经得到的共识和最新获得的成果进行概述。
收稿日期：2012年5月9日；修回日期：2012年5月20日；录用日期：2012年6月10日
关键词：CBL；CIPK
1. 引言
植物细胞通过Ca2+作为第二信使介导大量的信号传递，是信号传导网络的核心元件。细胞胞质内不同时间、空间的游离Ca2+浓度变化调控着植物的生长发育过程，如花粉管和根毛的发育[1]。细胞内Ca2+的另一个重要功能是对生物和非生物胁迫产生应激反应[2]，如胁迫下气孔的孔径变化、共生作用、光作用等。在这些信号传导过程中，Ca2+结合蛋白(Ca2+-Binding Proteins)起到了关键的信号传递作用，其时空表达模式、亚细胞定位和与Ca2+结合的亲和力决定了信号传导途径不同的和植物对特定逆境信号的特殊反应。Ca2+结合蛋白(也可称之为Ca2+感受器)主要包括3大类：钙离子依靠蛋白激酶CDPK(Calcium Dependent Protein Kinase)、钙调蛋白CaM(Calmodulin)和类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL(Calcineurin B-Like Protein)。CDPK是一类特殊的Ca2+结合蛋白，它同时包含Ca2+结合域和反应器——类蛋白激酶结构。而CaM和CBL则只拥有Ca2+感受器，所以他们需要和其他信号传导构件相作用来完成Ca2+信号的传导。CaM是Ca2+信号传导途径中发现较早，研究比较成熟的Ca2+感受器，它通过与各种信号传导构件广泛作用来传导Ca2+信号。这些传导构件包括转录因子、生理代谢所需各类酶、细胞结构蛋白等。CBL则是最新发现的一类Ca2+结合蛋白，因为与动物的钙调磷酸酶蛋白的B亚基非常类似而得名[3,4]。与CaM不同的是CBL主要与一类丝/苏氨酸蛋白激酶CIPKs相互作用进行Ca2+信号的传导。以前认为CBL只与CIPK作用传导Ca2+信号，但最新的发现表明拟南芥CBL3也与新的蛋白AtMTAN (5’-Methylthioadenosine Nucleosidase)相互作用[5]。本文主要围绕CBL和它们的作用蛋白CIPK，在它们的结构、功能以及它们如何对信号做出不同的反应的机制上对一些已经得到的共识和最新取得的成果进行概述。
2. CBL和CIPK蛋白的结构
CBL家族在水稻和拟南芥中分别含有10个基因[6,7]，所有的CBL蛋白都含有保守的Ca2+结合结构域EF(Elongation Factor)手型结构[7]。EF手型结构是一种螺旋–环–螺旋的结构模式，其中环为主要的钙离子绑定结构。通过控制环的大小EF手型结构可以特异性的绑定钙离子。典型的EF手型结构中环的部分包含12个氨基酸，它利用第1、3、5、7、9和12位上的氨基酸与钙离子作用。这其中第1位上的Asp，第6位上的Gly和第12位上的Glu是所有氨基酸中最保守的，体现了它们在结构和钙离子绑定功能上的重要作用，如Gly能够维持环结构的稳定性，该功能不能为其他任何氨基酸所替代[8]。CBL蛋白家族各个蛋白都拥有4个EF手型结构，但拥有的典型完整EF手型结构的数量却表现出很大的差异。CBL1和CBL9具有两个典型完整的EF手型结构，CBL6、CBL67、CBL610只有一个，而剩下的成员(在拟南芥中)则一个也没有[8]。并且很多EF手型结构第12个氨基酸位点上发生了氨基酸的替换，从而影响了它们与钙离子的结合。这些典型完整的EF手型结构的数量和结构上的差异在一定程度上表现出了不同CBL蛋白对钙离子的亲和程度不同。根据N末端结构域的不同，可以把CBL家族分为两个主要的大类：第一类包括CBL1，CBL4，CBL5，CBL8和CBL9，他们具有短的(43~48个氨基酸)N末端，同时该端具有脂肪修饰位点，但在CBL8中退化。脂肪修饰位点对CBL的亚细胞定位非常重要，如CBL4末端脂肪修饰位点的豆蔻酰化可以帮助其定位于细胞膜[8]；第二类包括CBL2，CBL3，CBL6，CBL7 and CBL10，这类蛋白具有长的N末端域，该结构域类似K+通道结合蛋白域(K+-Channel Interacting Proteins (KCIP))，并且没有脂肪修饰位点[9-11]。
通过与钙离子绑定，CBL发生了构象的转变，从而促进了它与CIPK的作用，但是具体机制还不是很清楚。已经发现的与CBL相近的CaM的构象转变，可以给我们一些启示。在没有绑定钙离子时，CaM呈现出一个封闭的构象。钙离子的结合则启动了CaM构象的转变，使得CaM呈现出一个开放的状态，两边各由一对EF手型结构组成的球型结构呈现出近90˚的夹角。开放的构象暴露出大面积的疏水表面，从而为后面的目标作用蛋白提供了作用点[12]。
CIPK家族在拟南芥含有25个基因。CIPK蛋白由两部分组成：激酶结构域(又称催化结构域)和C端相对较不保守的调节结构域。两者被一段连接结构连接。在调节结构域中有一段保守的NAF结构域(根据其最显著的3个氨基酸N，A和F命名)，它是CBL的结合位点，同时对激酶结构域中的活性环结构起到自抑制的作用。CBL在NAF部位的结合解除了NAF对活性环结构的抑制作用，启动了该结构的自磷酸化从而激活CIPK的活性[8]。
3. CBL和CIPK蛋白的功能
众所周知，蛋白的表达模式以及亚细胞定位在一定程度上暗示着该蛋白可能的功能。通过对CBL蛋白进行定位，发现他们主要定位在细胞膜和液泡膜上。考虑到这两大膜系统充当着两大钙离子库(细胞外钙离子和液泡内钙离子)的边界，这个现象正好印证了CBL在钙离子信号传导中充当着信号感受器的作用。
对CBL蛋白功能最早的报道为对拟南芥高盐逆境的研究。在该研究中，工作者发现了对盐浓度高度敏感(Salt Overly Sensitive)的突变体sos1、sos2和sos3。进一步的研究揭示了CBL/CIPK在其中的作用。现在的研究成果认为拟南芥中CBL4(sos3)与CIPK24 (sos2)在质膜上相互作用，激活H+/Na+交换体(sos1)，从而从细胞内泵出有毒的/过量的钠离子[13-15]，而液泡膜定位的CBL10与CIPK24相互作用的结果与CBL4的一致[11]。最近报道在大麦的研究上也发现了CBL4参与到对盐逆境的调节过程中的类似现象[16]。
对CBL1的研究则发现CBL1通过调节逆境相关转录因子的表达从而表现出对干旱、高盐和低温的耐受性[17]。另外，对水稻CBL8的研究同样发现CBL8响应了干旱和盐胁迫[18]。通过低温处理水稻，研究人员发现CBL2的表达量异常增高，进一步的亚细胞定位发现CBL2主要定位于液泡膜，从而揭示出了CBL2在糊粉层细胞液泡化过程中发挥的重要作用[19]。此外研究人员发现CBL9通过与CIPK3的结合来调节ABA在种子萌发的中作用[20]。CBL9和CBL1与CIPK1的作用则形成了依赖和非依赖ABA的反应体系，主要响应干旱、冷和盐[1]。最新的发现表明拟南芥CBL3与新的蛋白AtMTAN(5’-Methylthioadenosine Nucleosidase)相互作用调控乙烯或多胺的生物合成，从而调控植物生长发育和环境胁迫响应[5]。
这些功能在一定程度上说明了CBL蛋白以及其作用蛋白CIPK在钙离子信号传导尤其是逆境信号传导中的重要性。
4. 信号特异性的实现
如引言中所述，很多植物体内的生理生化反应以及对体外生物、非生物的应激都是通过钙离子信号来传导的。把目光聚焦在CBL-CIPK体系上，我们依然可以发现细胞对体内、外信号做出的形形色色的生理生化反应。但问题是，细胞是如何从及其相近的细胞质游离钙离子浓度变化中提取出不同的信号从而做出不同而又特异的反应的呢？这里列举了本人比较认可的几种解释。
首先，钙离子信号本身具有特异性。钙离子信号并不仅仅只有钙离子浓度的变化，还包含着时间和空间的信息[6]，如细胞质游离钙离子浓度增高的频率、持续时间以及亚细胞位点等信息[1]。细胞的膜系统从另一方面促进了钙离子信号的复杂化，如钙离子通过细胞内膜和细胞质膜的速率可以作为一个特殊的信息参量[1]。
其次，CBL和CIPK的时空表达，亚细胞定位和CBL对钙离子的亲和性从另一个方面解释了钙离子信号的特异性。正如上文结构部分所述，不同的CBL家族成员对钙离子的亲和性不同。此外在不同生长发育时期，不同的组织、细胞、亚细胞结构内某个CBL蛋白的表达量多少可以在很大程度上决定钙离子信号的传导途径的选择，从而做出截然不同的生理生化反应[6,8]。该原理对于CIPK一样适用。
另外，CBL本身以及其对CIPK的选择性和亲和性也在一定程度上决定了信号的特异性[6]。CBL通过和CIPK结合传导钙离子信号。但是不同的CBL蛋白对作用的CIPK激酶蛋白具有选择性，并且表现出不同的亲和性，这在一个方面为钙离子信号的特异性提供了可能。此外在CBL-CIPK结合体中，CBL发挥着重要的信号传导路径选择作用。如上文所述CBL1和CBL9两个蛋白都可以和CIPK1结合，当CIPK1和CBL1结合时，该结合体能够引起细胞对高盐的抵抗力。当CIPK1和CBL9结合时，该结合体能够对ABA的反应发挥作用[1]。
5. 展望
随着全球气候的异常变化，世界范围的粮食作物因为逆境因素(如干旱、冻害、盐渍、酸性土壤等)而减产或绝收，直接影响到人们的生活及其它方面。在此背景下，植物抗逆，特别是作物的抗逆研究和抗逆育种显得尤为重要。现代分子生物学技术的迅速发展，促使人们摆脱费力耗时的传统育种方式，进而通过转基因等遗传手段大量地改造现有农作物，以期在短时间内获得抗逆、优质、高产、环保的农作物新品种。正如本文CBL和CIPK蛋白的功能部分所述，许多CBL家族蛋白通过与他们特定的激酶蛋白相互作用可以在植物抗旱、冷、高盐等方面发挥作用，从而在分子抗逆育种上表现出极大地潜力。不过对这些资源的研究总体上还处于传统生理学研究和传统的作物育种领域，与发掘和利用这些资源的要求差距甚远。相信通过对它们的环境胁迫耐性等位基因的克隆，抗逆机理研究和通过转基因手段跨物种利用的研究将更好的推进对CBL和CIPK的认识和利用。
参考文献 (References)
[1] A. N. Dodd, J. Kudla and D. Sanders. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61: 593-620.
[2] P. J. White, M. R. Broadley. Calcium in plants. Annals of Botany, 2003, 92(4): 487-511.
[3] Q. Liu, M. Kasuga, Y. Sakuma, et al. Two transcription factors, DREB1and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in droughtand low-temperature-in droughtand low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 1998, 10(8): 1391-1406.
[4] J. Kudla, Q. Xu, K. Harter, et al. Genes for calcineurin B-like proteins in Arabidopsis are differentially regulated by stress signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 1999, 96(8): 4718-4723.
[5] S.-I. Oh, J. Y. Park, S. H. Yoon, et al. The arabidopsis calcium sensor calcineurin B-like 3 inhibits the 5’-methylthioadenosine nucleosidase in a calcium-dependent manner. Plant Physiology, 2008, 148(4): 1883-1896.
[6] S. Luan, J. Kudla, M. Rodriguez-Concepcion, et al. Calmodulins and calcineurin B-like proteins: Calcium sensors for specific signal response coupling in plants. Plant Cell, 2002, 14: S389- S400.
[7] U. Kolukisaoglu, S. Weinl, D. Blazevic, et al. Calcium sensors and their interacting protein kinases: Genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks. Plant Physiology, 2004, 134(1): 43-58.
[8] O. Batistič, J. Kudla. Plant calcineurin B-like proteins and their interacting protein kinases. Biochimica et Biophysica Acta, 2009, 1793(6): 985-992.
[9] M. Ishitani, J. Liu, U. Halfter, et al. SOS3 function in plant salt tolerance requires N-myristoylation and calcium binding. Plant Cell, 2000, 12: 1667-1678.
[10] O. Batistic, N. Sorek, S. Schultke, et al. Dual fatty acyl modification determines the localization and plasma membrane targeting of CBL/CIPK Ca2+ signaling complexes in arabidopsis. Plant Cell, 2008, 20: 1346-1362.
[11] B. G. Kim, R. Waadt, Y. H. Cheong, et al. The calcium sensor CBL10 mediates salt tolerance by regulating ion. The Plant Journal, 2007, 52(3): 473-484.
[12] S. Luan, J. Kudla, M. Rodrigyez-Concepcion, et al. Calmodulins and calcineurin B-like proteins: Calcium sensors for specific signal response coupling in plants. The Plant Cell, 2002, 14, 389-400.
[13] U. Halfter, M. Ishitani and J. K. Zhu. The arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2000, 97(7): 3735-3740.
[14] Q. S. Qiu, Y. Guo, M. A. Dietrich, et al. Regulation of SOS1, a plasma membrane Na+/H+ exchanger in Arabidopsis thaliana, by SOS2 and SOS3. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2002, 99(12): 8436-8441.
[15] F. J. Quintero, M. Ohta, H. Shi, et al. Reconstitution in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na+ homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2002, 99(13): 9061-9066.
[16] J. Rivandi, J. Miyazaki, M. Hrmova, et al. A sos3 homologue maps to HvNax4, a barley locus controlling an environmentally sensitive Na+ exclusion trait. Journal of Experimental Botany, 2010, 62(3): 1201-1216.
[17] V. Albrecht, S. Weinl, D. Blazevic, et al. The calcium sensor CBL1 integrates plant responses to abiotic stresses. The Plant Journal, 2003, 36(4): 457-470.
[18] B. J. Ma, Z. Gu, H. J. Tang, et al. Preliminary study on function of calcineurin B-like protein gene OsCBL8 in rice. Rice Science, 2010, 17(1): 10-18.
[19] Y. Hwang, C. B. Paul, Y. H. Cheong, et al. A gibberellin-regulated calcineurin B in rice localizes to the tonoplast and is implicated in vacuole function. Plant Physiology, 2005, 138(3): 1347-1358.
[20] K. P. Girdhar, J. J. Grant, Y. H. Cheong, et al. CalcineurinB-like protein CBL9 interacts with target kinase CIPK3 in the regulation of ABA response in seed germination. Molecular Plant, 2008, 1(2): 238-248.