Advances in Microbiology
Vol.3 No.03(2014), Article ID:14192,6 pages
DOI:10.12677/AMB.2014.33007

Construction of Gene Inactivation System for Leuconostoc mesenteroides

Xiaoyan Ju, Zhou Zhang, Wenyu Cheng, Hongxing Jin*

School of Chemical Engineering and Technology, Hebei University of Technology, Tianjin

Email: *jinhx87@126.com

Copyright © 2014 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Received: Aug. 1st, 2014; revised: Aug. 27th, 2014; accepted: Sep. 10th, 2014

ABSTRACT

To develop an efficient gene inactivation system for L. mesenteroides, tetracycline-resistant gene cassettes were ligated with pTA2 T vector. Then upsteam and downsteam flanking regions of the ack (acetate kinase) gene were directionally inserted into left and right MCS (multiple cloning site) of the T vector, respectively. The resulting homologous recombination suicide vector was transformed into Leuconostoc. The ack gene of chromosome was inactivated and a mutant strain was obtained. To confirm whether ack was inactivated, the ability of mutant strain synthesizing acetic acid was analyzed and an ack fragment was amplified by PCR. PCR analysis showed that a fragment of ack gene in the mutant strain was 1200 bp longer than that in the original strain. Compared with the original strain, the yield of acetic acid in the mutant was decreased by 49.1%. The results indicated that ack gene was successfully knocked out. The gene inactivation system for L. mesenteroides was constructed.

Keywords:Leuconostoc, Gene Inactivation, Homologous Recombination, Acetate Kinase

肠膜明串珠菌基因失活体系的建立

莒晓艳,张  舟,成文玉,金红星*

河北工业大学化工学院,天津

Email: *jinhx87@126.com

收稿日期:2014年8月1日;修回日期:2014年8月27日;录用日期:2014年9月10日

摘  要

构建肠膜明串珠菌的基因失活体系。四环素抗性基因表达盒连接到pTA2 T载体上,在T载体的左右多克隆位点上分别定向插入ack(乙酸激酶)的上、下游同源臂,构建成自杀性同源重组载体,转化明串珠菌,使染色体的ack失活,得到突变型。检测突变型产乙酸的量并利用PCR验证ack失活。与原始菌株相比,突变型的乙酸产量减少49.1%;突变型的ack PCR扩增产物比原始菌株的大1200 bp左右。成功地使ack基因失活,说明肠膜明串珠菌基因失活体系的构建成功。

关键词

明串珠菌,基因失活,同源重组,乙酸激酶

1. 引言

明串珠菌(Leuconostoc)是韩国泡菜、德国泡菜和腌菜等发酵蔬菜中的优势细菌,在保持产品的质量中起着重要作用[1] 。明串珠菌是耐氧的革兰氏阳性细菌[2] ,底物通过戊糖磷酸解酮酶(Pentose PhosphoKetolase, PPK)途径而脱氢并产生能量(见图1)。

明串珠菌在食品和医药工业中具有生成双乙酰、葡聚糖、甘露醇和2, 3-丁二醇、代谢产生细菌素等应用[3] [4] 。明串珠菌是美国FDA认可的GRAS菌,也是国家卫计委认可的安全菌[5] ,不产内毒素,能分泌特异性胞外蛋白且没有蛋白降解活性,因此明串珠菌是表达异源蛋白的很好的候选菌[6] 。

产业升级转化过程中甘露醇和2, 3-丁二醇等化学品需要微生物发酵产生,从而有利于绿色和环保。还有,明串珠菌的染色体基因组只有2 Mb左右[7] ,故发酵周期短且可作为底盘生物或精简基因组而构建成优势小基因组微生物。因此,明串珠菌具有巨大的应用价值,已成为国内外学者的研究热点[8] -[15] 。

Figure 1. The main carbon metabolic pathway of L. mesenteroides

图1. 肠膜明串珠菌主要碳代谢途径

本文以乙酸激酶基因ack为目标序列,以四环素为筛选标记,构建自杀性重组质粒,转化肠膜明串珠菌,使染色体上基因失活,获得突变型菌株。通过PCR扩增和产物检测,验证基因失活体系的构建成功。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 菌株与质粒

本文所用的菌株和质粒,见表1

2.1.2. 试剂和仪器

工具酶为TaKaRa的;其它试剂为分析纯;主要仪器有DL9700型基因扩增仪、Bio-Rad Gene Pulser XcellTM电击仪、722N型可见分光光度计。

2.1.3. 培养基和培养条件

在37℃、150 r/min下用LB培养大肠杆菌;在30℃、120 r/min下用MRS[16] 培养肠膜明串珠菌。

2.2. 方法

2.2.1. DNA操作

明串珠菌基因组DNA的提取参照文献[16] ,电转化参照文献[9] 。

大肠杆菌的质粒提取参照文献[17] ,大肠杆菌的转化采用CaCl2法。

引物序列见表2,PCR扩增过程见表3

2.2.2. ack的PCR扩增与测序

参照Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293(GenBank accession number CP000414)的乙酸激酶基因(ack)序列设计引物对A1-A2,扩增ack。将扩增产物连接到pTA2-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,送样测序。

Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this study

表1. 实验所用的菌株和质粒

Table 2. Primers used in this study

表2. 实验所用的引物

Table 3. Steps of PCR

表3. PCR步骤

2.2.3. 同源重组载体的构建

参照质粒pBR322序列,设计引物对T1-T2,扩增四环素抗性基因表达盒,将扩增产物连接到pTA2-T上,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒得到中间载体pTA2-Tet。根据扩增的ack序列设计引物对U1-U2,扩增ack上游片段,将扩增产物连接到pTA2-Tet的KpnI和XhoI位点上,转化DH5α,提取质粒得到pTA2-T-U;设计引物对D1-D2,扩增ack下游片段,将扩增产物连接到pTA2-T-U的PstI和XbaI位点上,转化DH5α,提取质粒得到同源重组载体pTA2-T-U-D。

2.2.4. 肠膜明串珠菌的电转化

同源重组载体pTA2-T-U-D转化肠膜明串珠菌,从平板上挑取单菌落进行液体MRS培养,用5 μg/mL四环素和5 μg/mL氨苄检验菌株的抗性。保留具有四环素抗性且对氨苄敏感的菌株,作为疑似失活菌株。

2.2.5. 突变型菌株的PCR验证

分别在ack基因上游和下游片段序列上设计引物Y1、Y2,提取疑似失活菌株的基因组DNA作为模板,通过PCR验证菌株的ack基因是否失活。

2.2.6. 发酵实验

以1%接种于MRS中,发酵24 h后参照文献[18] -[21] 检测培养基中的乙酸、乳酸、乙醇、双乙酰和甘露醇含量。

3. 结果与分析

3.1. ack基因克隆和序列同源性

约1.1 kb的PCR扩增片段连接到pTA2-T载体上,转化DH5α,获得重组子,重组质粒命名为pTA2-ack。测序分析表明长度为1112 bp,与L. mesenteroides ATCC8293的乙酸激酶基因序列比对结果:核酸序列同源性为99%,有9个碱基的差异,氨基酸序列同源性为100%。已提交到GenBank,接收号为JF837336。

3.2. 同源重组载体的构建

以质粒pBR322为模板,扩增TetR基因表达盒,获得的PCR产物长约1.2 kb,与pTA2-T载体连接,重组质粒命名为pTA2-Tet。扩增的ack上游片段为约500 bp,与pTA2-Tet连接,重组质粒命名为pTA2-T-U。扩增的ack下游片段大小约450 bp,与pTA2-T-U连接,同源重组载体命名为pTA2-T-U-D。

3.3. 疑似失活菌株的筛选

将pTA2-T-U-D经电击转化肠膜明串珠菌后,涂布于含四环素的MRS平板上,保留抗四环素而对氨苄青霉素敏感的重组子(发生二次交换的),废弃对四环素和氨苄青霉素都具有抗性的重组子(只发生一次交换的),从而获得疑似失活菌株。

3.4. 疑似失活菌株的PCR检测

为了验证疑似失活菌株染色体上的ack基因已被失活,对重组子进行了PCR检测。分别以CGMCC 1.10327(原始菌株)和疑似失活菌株的染色体DNA为模板,用相同的引物对Y1-Y2进行PCR扩增,对得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳。疑似失活菌株的扩增产物长度比CGMCC1.10327的大1200 bp左右(图2),与预期结果一致。将该疑似失活菌株命名为Leu ack::TetR

3.5. 种菌株的生理特性比较

为了进一步验证ack基因的失活并研究ack基因失活对肠膜明串珠菌碳代谢的影响,用MRS进行发酵24 h时并考察乙酸、乙醇、乳酸、双乙酰、甘露醇的量。

在相同条件下,CGMCC1.10327和Leu ack::TetR两种菌株的生物量基本一致。比较两者的代谢产物

Figure 2. Characterization of defined ack inactivated mutant by PCR analysis

M: DNA marker; 1: PCR fragment of ack of CGMCC1.10327; 2: PCR fragment of ack of presumed mutant

图2. ack基因失活菌株的PCR鉴定

Table 4. Comparison of fermentation parameters of the two strains (Unit: g/L)

表4. 两菌株的发酵参数比较(单位:g/L)

表明,突变菌株的乙酸浓度为0.20 g/L,比原始菌株少49.1%;突变菌株的双乙酰浓度为1.21 g/L,比原始菌株少16.3%;突变菌株的乙醇浓度为2.21 g/L,比原始菌株高8.3%;产乳酸和甘露醇的差不多(见表4)。

4. 讨论

自然情况下,菌体内自发的同源重组效率相当低。2008年韩国的Eom[22] 以摘要形式报道过柠檬明串珠菌的基因失活,此后还没有明串珠菌的相关报道。本研究成功建立了肠膜明串珠菌的基因失活体系。

本研究使肠膜明串珠菌的ack基因失活,从而阻碍了乙酸合成,导致乙酸的量减少和乙醇的量增加,符合理论上的预期结果。由此可见,乙酸的合成没有完全阻断,因为染色体上存在另一个拷贝的乙酸激酶基因(已克隆该ack,GenBank的接收号为JF809796)。若使另一个拷贝的ack也失活,就可以改造成为高产乙醇的明串珠菌菌株。

5. 结论

本研究成功地使染色体的ack基因失活,说明肠膜明串珠菌基因失活体系的构建成功。

项目基金

天津市科技计划项目(“明串珠菌发酵生产甘露醇研究”,No. 12ZXCXSY06900);河北省自然科学基金项目(“通过基因敲除研究明串珠菌的中心碳代谢调控”,No. C2011202112);河北省科技支撑计划项目(“以甘蔗/红糖为原料用明串珠菌发酵生产甘露醇”,No. 13212405)。

参考文献 (References)

  1. [1]   成文玉, 金红星 (2012) 明串珠菌的基因研究进展. 中国酿造, 2, 24-28.

  2. [2]   Eom, H.-J., Cho, S.K., Park, M.S., et al. (2010) Characterization of Leuconostoc citreum plasmid pCB18 and development of broad host range shuttle vector for lactic acid bacteria. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15, 946-952.

  3. [3]   Yi, A.-R., Lee, S.-R., Jang, M.-U., et al. (2009) Cloning of dextransucrase gene from Leuconostoc citreum HJ-P4 and its high-level expression in E. coli by low temperature induction. Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, 829- 835.

  4. [4]   成文玉, 金红星, 金正焕 (2012) 明串珠菌的碳代谢调控研究进展. 中国酿造, 6, 6-8.

  5. [5]   卫生部 (2012) 关于将肠膜明串珠菌肠膜亚种列入可用于食品的菌种名单的公告. 中国食品卫生杂志, 4, 305.

  6. [6]   Hemme, D. and Foucaud-Scheunemann, C. (2004) Leuconostoc, characteristics, use in dairy technology and prospects in functional foods. International Dairy Journal, 6, 467-494.

  7. [7]   明串珠菌的基因组. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=leuconost oc

  8. [8]   Eom, H.-J., Moon, J.-S., Cho, S.K., et al. (2012) Construction of theta-type shuttle vector for Leuconostoc and other lactic acid bacteria using pCB42 isolated from kimchi. Plasmid, 67, 35-43.

  9. [9]   张舟, 成文玉, 金红星 (2014) 明串珠菌的稳定高效电转化. 中国乳品工业, 1, 18-20.

  10. [10]   崔虎山, 李冬梅, 李艳茹等 (2013) 抑菌性明串珠菌的筛选及发酵特性研究. 生物技术, 6, 93-96.

  11. [11]   李自强, 成文玉, 金红星 (2013) 牛乳中添加不同果汁对明串珠菌发酵产双乙酰的影响. 河北工业大学学报, 4, 44-47.

  12. [12]   成文玉, 金红星, 胡炎华等 (2010) 明串珠菌筛选与分类的研究进展. 中国酿造, 3, 7-9.

  13. [13]   金红星, 成文玉 (2012) 明串珠菌发酵产甘露醇的研究进展. 中国酿造, 10, 4-6.

  14. [14]   金红星, 成文玉, 周亚欣 (2013) 提取明串珠菌质粒方法的优化. 中国调味品, 2, 84-86.

  15. [15]   周亚欣 (2013) 明串珠菌乙醛脱氢酶基因失活的研究. 硕士论文, 河北工业大学, 天津.

  16. [16]   Kim, J., Chun, J. and Han, H.-U. (2000) Leuconostoc kimchii sp. nov., a new species from kimchi. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 5, 1915-1919.

  17. [17]   Sambrook, J. and Russell, D.W., 著 (2002) 黄培堂等, 译. 分子克隆实验指南第三版. 科学出版社, 北京, 27-29.

  18. [18]   金红星, 史建波, 成文玉等 (2011) 以蔗糖为原料明串珠菌发酵生产甘露醇. 食品与发酵工业, 2, 91-93.

  19. [19]   王秉栋, 张立克, 于静涛等 (1984) 肉中乳酸的分光光度微量测定法. 江苏农学院学报, 4, 57-58.

  20. [20]   何惠昭, 郑战军, 吴春燕 (2003) 一种简单快速检测冰乙酸含量的方法. 酿酒, 2, 79-80.

  21. [21]   林仁权, 胡文兰, 陈国亮 (2006) 重铬酸钾氧化分光光度法测定酒中乙醇含量. 浙江预防医学, 3, 78-79.

NOTES

*通讯作者。

期刊菜单