Immunology Studies
Vol.03 No.01(2015), Article ID:15300,10 pages
10.12677/IS.2015.31001

Efficient Expression of sTNFRII-gAD-Fc Fusion Protein in CHO Cell

Caihong Wang1*, Ying Liu2*, Qinzhen Cai1, Hongmei Yang1, Lisha Ma1, Jimin Gao1#

1Zhejiang Provincial Key Laboratory for Technology & Application of Model Organisms, School of Laboratory Medicine, School of Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou Zhejiang

2Yantai Central Hospital of Longkou Mining, Yantai Shandong

*第一作者。

#通讯作者。

Email: wch995041@163.com, #jimingao64@163.com

Received: May 7th, 2015; accepted: May 23rd, 2015; published: May 27th, 2015

Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

ABSTRACT

In order to produce the soluble TNF receptor (sTNFR) II with good neutralizing activity against TNFα, we constructed the fusion gene sTNFRII-gAD-Fc, which encoded human sTNFRII, the globular domain of adiponectin (gAD) and IgG1 Fc, and efficiently expressed it through a “GC-rich” method for mammalian gene expression in CHO-S cells, and further established the process of serum-free suspension fed-batch culture. The fusion gene of sTNFRII-gAD-Fc was obtained by recombinant PCR, and then cloned into pMH3 expression plasmid with GC-rich motif. The plasmid was electrotransfected into CHO-S cells, which were selected by G418. sTNFRII-gAD-Fc fusion protein was analyzed by dot blot and Western blot. The TNFα-antagonizing activity of sTNFRII-gAD- Fc was determined through TNFα-induced L929 cytotoxicity assay. The suspension cultures of sTNFRII-gAD-Fc-expressing CHO-S cells were performed in a step-wise manner. We assessed the expression levels of sTNFRII-gAD-Fc in batch culture in shake flaskes (500 mL), fed-batch culture in roller bottles (2 L), and the bioreactor (7.5 L) with inoculating concentration of 2 × 106 cells/ml of sTNFRII-gAD-Fc-expressing CHO-S cells, respectively. Having reached up to more than 4 × 106 cells/ml in fed-batch cultures, the cells were added semi-continuously with the feed medium to keep the glucose concentration at 2 g/L. Stable expression clones (75 μg/mL) were obtained, and sTNFRII-gAD-Fc fusion protein was expressed as dimer and polymer forms in the supernatant, and displayed very strong TNFα-neutralizing activity. The yields of sTNFRII-gAD-Fc fusion protein were about 10.0 mg/L, 18.3 mg/L and 20.5 mg/L, respectively, in 60 mL batch culture, 200 mL and 3 L fed-batch cultures. Our efficient expression of sTNFRII-gAD-Fc fusion protein by CHO-S cells had laid a good basis for the development of pilot production process in the suspension fed-batch culture.

Keywords:sTNFRII-gAD, IgG1 Fc, TNF Antagonist, GC-Rich Expression System, Suspension Fed-Batch Culture

sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白在CHO细胞中的高效表达

王彩虹1*,柳英2*,蔡秦真1,杨红枚1,马丽莎1,高基民1#

1温州医科大学检验医学院、生命科学学院浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江 温州

2烟台市龙口矿务局中心医院ICU,山东 烟台

Email: wch995041@163.com, #jimingao64@163.com

收稿日期:2015年5月7日;录用日期:2015年5月23日;发布日期:2015年5月27日

摘 要

构建了人肿瘤坏死因子受体II胞外区、人脂联素球部与人IgG1 Fc的融合基因sTNFRII-gAD-Fc的真核表达载体,在CHO-S细胞中快速高效表达,探索了无血清悬浮流加培养工艺。应用重组PCR将人IgG1 Fc基因片段与sTNFRII-gAD基因片段融合,构建pMH3-sTNFRII-gAD-Fc表达载体,电转染至CHO-S细胞,挑选G418抗性的高表达单克隆,斑点杂交半定量分析和Western blot分析sTNFRII-gAD-Fc的表达,Protein A-Agarose纯化,以及拮抗TNFα的生物活性测定。最后在摇瓶、转瓶及生物反应器中进行了逐级放大的无血清悬浮批次及流加培养,即:2.0 × 106 cells/mL的接种密度,当达到4.0 × 106 cells/mL以上时开始流加培养并以每日葡萄糖的残余量2 g/L左右作为流加体积的控制参数。成功构建pMH3- sTNFRII-gAD-Fc表达载体,检测到sTNFRII-gAD-Fc在CHO-S细胞培养上清中以二聚体和多聚体形式表达,获得了高表达(75 μg/mL)单克隆细胞株,且该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。在摇瓶中无血清批次培养和转瓶及生物反应器中流加培养时产量分别为10.0 mg/L、18.3 mg/L和20.5 mg/L。利用CHO-S细胞系统成功实现了sTNFRII-gAD-Fc 融合蛋白的快速高效表达,为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。

关键词 :可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部,人免疫球蛋白G1 Fc,TNF拮抗剂,“富含GC”表达体系,悬浮流加培养

1. 引言

TNFα是一种多能性细胞因子,参与许多重要的生理功能,但其过表达则会破坏机体的免疫平衡,导致自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)的发生。中和体内过剩的TNFα或抑制TNFα活性是治疗这类疾病的有效措施。可溶性TNFRII(sTNFRII)单体是TNFα的天然拮抗剂[1] ,但其与TNFα间的亲和力低,且在血液循环中的半衰期很短,故拮抗TNFa的能力非常有限。因二聚体化效应,sTNFRII-Fc融合蛋白(Etanercept)拮抗TNFa的能力是相应sTNFRII单体的50~1000倍[2] [3] 。借助脂联素球部(gAD)可自行形成同源三聚体的特性 [4] ,本实验室构建了优于sTNFRII-Fc融合蛋白、三聚体化的sTNFRII-gAD融合蛋白 [5] 。然而,我们发现,sTNFRII-gAD在制备过程中仍大量以单体蛋白形式存在 [6] [7] 。因此,本研究拟借助人IgG1的Fc片段肽链间的二硫键能形成同源二聚体的特性,将sTNFRII-gAD基因与IgG1 Fc基因相连,成功利用“富含GC”的哺乳动物细胞CHO-S表达体系 [8] ,实现了sTNFRII-gAD-Fc的快速高效表达,且以二聚体和多聚体的形式存在,从而避免了单体sTNFRII的形成。同时,初步探索了无血清悬浮流加培养工艺,为建立一套高密度、高效表达融合蛋白的中试流加培养工艺奠定了基础。

2. 材料与方法

2.1. 质粒、菌种和细胞

pAAV2-sTNFRII-gAD由本实验室保存,pMH3质粒,CHO-S细胞由杭州安瑞普生物科技公司惠赠,CHO-S细胞已经过无血清培养基B001悬浮驯化可悬浮生长,在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中可贴壁生长;L929细胞购自美国ATCC,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。

2.2. 主要试剂和仪器

Platinum Pfx DNA聚合酶购自Invitrogen公司;EcoR I和Not I限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自宝生物公司(Takara Biotechnology Co., Ltd.);质粒小提试剂盒购自Qiagen公司;Ficoll试剂和Trizol试剂盒购自北京索来宝科技有限公司;G418购自Merck公司;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco;放线菌素D购自Fluka;鼠抗人脂联素单抗由本元正阳基因技术有限公司谭淑萍老师提供;鼠抗人TNFRII单抗购自Abcam公司;蛋白Marker,AP标记的羊抗鼠IgG 抗体和HRP标记的羊抗鼠的IgG抗体,BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒,BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)和BCA法蛋白含量测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所;DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清购自Gibco;无血清培养基B001和流加培养基F001均购自杭州安瑞普生物科技公司。人TNFα国家标准品(3500 U/支)由中国药品生物制品检定所提供;hTNFR-Fc阳性对照品由复旦张江生物医药公司提供。琼脂糖亲和介质Protein A购自国家生化工程技术研究中心(北京)。细胞转瓶培养器及PY/PYC系列恒温培养箱购自美国精骐有限公司。7.5LCelliGen310生物反应器购自美国NBS (New Brunswick Scientific)公司。

2.3. 重组质粒的构建

抽取20 ml健康人外周血于肝素抗凝管中,以PBS稀释1倍后用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。按Trizol试剂盒操作说明提取总RNA,取1 μg进行逆转录,以逆转录后的cDNA为模板,设计2对引物(如表1),引物合成由Invitrogen公司完成,利用F1和R1一对引物PCR扩增得到目的基因IgG1Fc。反应条件:95℃预变性5 min;94℃ 15 s,58℃ 30 s,68℃ 45 s,28个循环;68℃ 10 min。扩增得到目

Table 1. Oligonucleotide primers used for the amplification of human sTNFRII-gAD and IgG1 Fc coding regions

表1. 人sTNFRII-gAD和 IgG1 Fc编码区扩增的引物序列

注释:限制性内切酶酶切位点侧翼序列已用下划线标出,EcoRI: GAATTC; Not I: GCGGCCGC。

的基因IgG1 Fc大小为699 bp。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,试剂盒回收目的片段。同时,以融合蛋白基因pAAV2-sTNFRII-gAD为模板设计引物F2和R2。PCR扩增条件:95℃预变性5 min;94℃ 15 s,60℃ 30 s,68℃ 75 s,28个循环;68℃ 10 min,扩增得到目的基因sTNFRII-gAD大小为1183 bp。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,试剂盒回收目的片段。然后,同时以胶回收的目的基因sTNFRII-gAD和IgG1Fc为模板,以F2和R1为引物,进行重组PCR,将这两段不相邻的基因片段连接扩增出融合基因sTNFRII-gAD-Fc大小为1887 bp。PCR扩增条件为95℃ 5 min;94℃ 15 s,60℃ 30 s,68℃ 2 min,28个循环;68℃ 10 min。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳,试剂盒回收目的片段,用EcoR I和Not I进行双酶切。同样用这两种酶切载体pMH3。用T4 DNA连接酶将sTNFRII-gAD-Fc目的片段与pMH3载体片段连接,转化至DH5α,挑取氨苄抗性克隆进行酶切鉴定,并直接送上海华大基因测序鉴定,得到重组表达质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc。

2.4. 转染及稳定高表达单克隆细胞株的获得

采用电穿孔系统(Bio-Rad)进行转染,取5 × 106个CHO-S细胞,PBS洗涤2遍,200 μL PBS重悬,将25 μg pMH3-sTNFRII-gAD-Fc质粒及10 μg鲑鱼精DNA混匀加入上述细胞悬液后转移到电转杯,冰浴1 min,电转仪参数:电压160 V、电击时间15 ms,电击一次,取出,立即冰浴1 min,同法再电击一次。将电转后的细胞悬液转入2个预先加好含10% FBS的DMEM/F12培养基的细胞培养皿中,轻轻摇晃使细胞分布均匀,37℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后,换用含G418的选择培养基(G418浓度为1.5 mg/mL),G418持续加压筛选两周后,刮取法挑选单克隆,即待单个细胞长成集落斑点(克隆)后(50~100个克隆集落/培养皿最佳),弃去皿内培养基,加入2~3 mL培养基。根据镜面反光原理,用10 μL枪头刮取单克隆细胞团于96孔板中,此时撤去G418,37℃、5% CO2培养箱中培养。培养5~7天,待细胞长满后换无血清的DMEM/F12,培养24 h后取上清,斑点杂交(dot blot)检测目的蛋白表达量。经半定量分析挑出高表达株,此单克隆记为一次克隆。为获取高纯度高表达单克隆,选取表达量前三的一次克隆,消化后计数,分别取50~100个单个细胞于9 cm细胞培养皿中培养,同法挑取二次、三次克隆。冻存表达量最高的三个克隆作为种子细胞。

2.5. 无血清悬浮批次培养和流加培养

2.5.1. 种子细胞的无血清悬浮驯化

选取稳定高表达量的种子细胞,用含10% FBS的DMEM/F12的培养基在T75方瓶中贴壁培养,待3个T75方瓶中的细胞汇合度达90%且状态良好时,胰酶消化后,弃除胰酶,用30 mL无血清培养基B001 (添加了100 μM次黄嘌呤、16 μM胸腺嘧啶核苷及胰岛素生长因子)重悬细胞,并吹打成单个细胞避免成团,接种到250 mL摇瓶中,初始密度至少约2.0 × 106 cells/mL,置于37℃恒温摇床,120 r/min振荡培养。每天检测活细胞密度,台盼蓝染色检测细胞活力,直到细胞生长每天可以倍增,状态良好,dot blot检测蛋白表达稳定,即得到悬浮驯化成功的工程细胞株。

2.5.2. 工程细胞株在摇瓶中无血清批次培养

以2.0 × 106 cells/mL初始密度接种到500 mL摇瓶中,初始工作体积为60 mL,置于37℃恒温摇床,120 r/min振荡培养,进行无血清悬浮批次培养。每天取样观察计数并台盼蓝染色检测细胞活力,dot blot检测蛋白的表达,当细胞活力降至60%时终止批次培养。

2.5.3. 工程细胞株在转瓶中无血清流加培养

在转瓶中进行无血清悬浮流加培养,以2.0 × 106 cells/mL初始密度接种到2 L摇瓶中,初始体积为100 mL,置于37℃恒温转瓶旋转机,720 r/h滚动培养,扩种至200 mL时,不再扩大培养体积。当细胞密度达4.0~5.0 × 106 cells/mL左右时开始间歇流加高糖流加培养基F001,流加体积以控制每天的葡萄糖残余量在2 g/L左右为准。每天取样观察计数并检测细胞活力,测定葡萄糖,当细胞活力降至60%时终止培养。

2.5.4. 工程细胞株在生物反应器中无血清流加培养

接种2 L密度为2.0 × 106 cells/mL的工程细胞株到7.5 LCelliGen 310生物反应器中,进行全悬浮无血清培养,扩种至3.0 L,不再扩大培养体积,当细胞密度达4.0 × 106 cells/mL左右时开始间歇流加高糖流加培养基F001,流加体积以控制每天的葡萄糖残余量在2 g/L左右为参考。反应器操作条件:pH (7.08 ± 0.1),DO为50%空气饱和度,温度为37℃,搅拌速度为60 r/min,第3天搅拌速度下调至40 r/min。培养过程中每隔约24 h取样,观察计数并检测细胞活力,测定葡萄糖。连续培养期间以RPC软件进行数据采集,实现计算机在线控制,维持细胞培养条件的稳定,当细胞活力降至60%时终止培养。

2.6. Dot blot检测和Western blot分析融合蛋白sTNFRII-gAD-Fc

将每次收集的无血清培养24 h的上清各取5 µL,分别点到NC膜上,用封闭液(5%脱脂牛奶,TBST配制) 37℃封闭1 h。弃封闭液,TBST洗涤NC膜3次后,加入1:2000 (用TBST稀释) 的鼠抗人TNFR单抗或鼠抗人脂联素单抗,37℃孵育1 h。回收单克隆抗体,TBST洗涤NC膜3次后,加入1:3000 (用TBST稀释)的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体,室温孵育45 min,用TBST洗膜3次,ECL曝光,观察结果。

取20 μL无血清DMEM/F12培养24 h的上清,加入5 μL 5 × Loading buffer,6%分离胶进行SDS-PAGE电泳。然后用湿胶转移仪将蛋白转移至PVDF膜上,取出PVDF膜,用封闭液(5%的脱脂奶粉)封闭1 h。弃封闭液,TBST洗膜3次后,加入1:2000稀释的鼠抗人TNFR单抗或鼠抗人脂联素单抗(用TBST稀释),室温孵育1 h。回收单克隆抗体,用TBST洗膜3次,加入1:3000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(用TBST稀释),室温孵育1 h;用TBST洗膜3次。取出PVDF膜,在膜上滴加显色液BCIP/NBP,避光显色10~15 min,用超纯水洗涤膜终止反应,观察结果。

2.7. sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的纯化

将收获的培养上清经12,000 r/min,4℃离心10 min后,用0.22 μm滤膜过滤进行蛋白的粗分离,然后用Protein A-Agarose亲和层析法分离纯化。将收集到的蛋白洗脱液峰进行6% SDS-PAGE电泳分析,收集含有目标融合蛋白的峰获的融合蛋白纯品。

2.8. sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的生物活性测定

以L929为靶细胞,检测融合蛋白sTNFRII-gAD-Fc拮抗TNFα杀伤L929细胞的中和活性 [9] 。取对数生长期的L929细胞,胰酶消化计数,调整细胞密度1.5 × 105 cells/mL,在96孔板中每孔加入100 μL的细胞悬液,37℃、5% CO2培养箱培养过夜。第2天将无血清悬浮培养的CHO-S/pMH3-sTNFRII-gAD-Fc的上清用含20 μg/mL放线菌素D、20 U/mL TNFα的RPMI1640培养基4倍比梯度稀释,共10个梯度。弃去96孔板中L929细胞的上清,加入前面稀释好的待测样品,每孔100 μL,每个梯度设3个复孔。同时未转染的CHO-S细胞无血清悬浮培养的上清用含20 μg/mL放线菌素D、20 U/mL TNFα的RPMI1640培养基稀释作为阴性对照。继续37℃、5% CO2培养24 h,每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液,再培养4 h。将96孔板中的液体轻轻弃去,加入100 μL DMSO,37℃孵育30 min,检测各孔的OD570值。

3. 结果

3.1. 重组表达质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc的结构

重组表达质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc结构如图1所示。其中包括鸡β-actin启动子、sTNFRII-gAD-Fc融合基因、polyA加尾信号、新霉素抗性的neo基因及三个非编码的富含GC的DNA片段。新霉素抗性的neo基因便于转染后G418筛选,以得到稳定转染的细胞株。该载体最大的优势是在目的基因的N’和C’端分别加入一段非编码的富含GC的DNA片段,另一非编码的富含GC的DNA片段位于β-actin启动子N’端,这有利于大幅度提高目的蛋白在哺乳动物宿主细胞中的表达。

3.2. 酶切鉴定

用EcoR I、Not I双酶切重组质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc,经1.2%的琼脂糖凝胶电泳可见酶切出的条带与sTNFRII-gAD-Fc预期大小(1887 bp)一致(如图2)。通过DNA直接测序,在IgG1 Fc片段上存在2个点突变,即其第90位的GTC (缬氨酸)突变为ATC (异亮氨酸),186位的GTC (缬氨酸)突变为GAC (天冬氨酸),但后期蛋白的表达及活性测定分析均表明这两处的点突变并不影响蛋白的结构与生物活性。

3.3. 稳定高表达sTNFRII-gAD-Fc的单克隆细胞株的获得

重组表达质粒pMH3-sTNFRII-gAD-Fc转染CHO-S细胞后,瞬时转染24 h时,分别用抗人脂联素单抗和抗TNFRII单抗进行dot blot检测分析,结果均可见转染后的CHO-S细胞的培养上清中有sTNFRII-gAD-Fc的分泌表达(如图3(a))。随后通过G418筛选及三次单克隆挑选,利用dot blot半定量分析筛选出高效稳定表达sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的单克隆细胞株IIIF12。用已知浓度的sTNFRII-Fc融合蛋白作为标准品,分别稀释成100、75、50、25、12.5、6.25 µg/mL,dot blot半定量分析转染后的最高表达株,96孔板中最高表达的单克隆细胞培养24 h上清中sTNFRII-gAD-Fc的含量约相当于75 μg/mL (如图3(b))。

用免疫印迹法分析还原状态/非还原状态的sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白样品(图3(c),图3(d))。对于还原状态的样品,用抗人脂联素单抗检测在约75 kDa处有特异性条带,比sTNFRII-gAD-Fc预期的蛋白分子量69 kDa要大,这可能是由于糖基化作用导致的;而用抗人sTNFRII单抗检测未见特异性条带。这正好与先前实验的结果抗TNFRII单抗只能识别sTNFRII的空间表位(而非线性表位),而抗脂联素单抗可识别gAD线性表位一致 [6] 。然而,对于非还原状态的样品,用脂联素单抗及TNFRII单抗检测培养上清在约75 kDa处均未见特异性条带,在大约170 kDa处及远大于250 kDa处分别出现特异性条带,提示CHO-S细胞表达分泌至上清中的sTNFRII-gAD-Fc以二聚体和多聚体形式存在,不存在单体蛋白。

3.4. 无血清悬浮批次和流加培养的比较及sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的纯化

将最终选出的高效稳定的单克隆CHO-S/pMH3-sTNFRII-gAD-Fc IIIF12成功驯化适应悬浮生长,依次进行无血清悬浮批次及流加培养,逐级放大悬浮培养规模以探索流加培养工艺,培养时间平均在6~8 d,每天取样dot blot检测上清中sTNFRII-gAD-Fc的表达(如图4(a)),可见工程细胞株在无血清悬浮培养过程中持续累积分泌sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白。比较批次与流加培养细胞生长状况及sTNFRII-gAD-Fc蛋白产量(如表2),流加培养的培养时间较批次培养延长,蛋白产量也明显增加。此外,由转瓶中流加培养放大到生物反应器中时,细胞活力及密度保持较好,sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的产量也较稳定且有所提高,提示小规模悬浮流加培养可放大,为后期更大规模的流加培养奠定基础。

经Protein A-Agarose亲和层析分离纯化收获的培养上清时出现一个洗脱峰,收集该峰,经6% SDS-

Figure 1. Diagrams of the recombinant plasmid pMH3-sTNFRII-gAD-Fc

图1. pMH3-sTNFRII-gAD-Fc质粒结构示意图

Figure 2. Identification of sTNFRII-gAD-Fc and pMH3-sTNFRII-gAD-Fc by PCR and enzyme digestion. (Lane 1: DNA marker BM 10000; lane 2: sTNFRII-gAD; lane 3: IgG1 Fc; lane 4: sTNFRII-gAD-Fc; lane 5: pMH3-sTNFRII-gAD-Fc digested with EcoR I and Not I)

图2. sTNFRII-gAD-Fc的PCR鉴定和pMH3-sTNFRII-gAD-Fc质粒的酶切鉴定

Figure 3. Dot blot and Western blot analysis of sTNFRII-gAD-Fc fusion protein in the supernatants. (a) Confirmation of ex pression of sTNFRII-gAD-Fc after transiently transfected for 24h by protein dot blot with monoclonal antibody against TNFRII and adiponectin; (b) Semi-quantitative analysis of expression of sTNFRII-gAD-Fc after clone selection by protein dot blot with monoclonal antibody against TNFRII. Lanes 1: positive controls (sTNFRII-Fc ) at 5 µL of 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL, 12.5 µg/mL and 6.25 µg/mL; Lane 2: Supernatants from three of the 1st, 2nd, and 3rd hyperexpression clones after cultured for 24 h in 96-well plates. (c) and (d) Western blot analysis of sTNFRII-gAD-Fc fusion protein with monoclonal antibody against adiponectin (c) and TNFRII (d): Lane 1 molecular weight markers (kDa); lane 2 non-reduced sTNFRII-gAD-Fc; lane 3 reduced sTNFRII-gAD-Fc

图3. 蛋白斑点杂交(a),(b)和免疫印迹分析(c),(d)鉴定培养上清中sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的表达

Figure 4. Confirmation of continuous expression of the fusion protein sTNFRII-gAD-Fc by protein dot blot with mono clonal antibody against TNFRII (a) and SDS-PAGE analysis of purified sTNFRII-gAD-Fc (b). (a) Detection of sTNFRII- gAD-Fc fusion protein in the supernatants of CHO-S/pMH3-sTNFRII-gAD-Fc cells in batch and fed-batch cultures everyday. Lanes 1: positive controls (sTNFRII-Fc) at 5 µL of 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50µg/mL, 25 µg/mL, 12.5 µg/mL, 6.25 µg/mL and 3.125 µg/mL; lane 2: the supernatants of 60 mL batch culture; lane 3: the supernatants of 200 mL fed-batch culture; lane 4: the supernatants of 3 L fed-batch culture. (b) SDS-PAGE analysis of purified sTNFRII-gAD-Fc. Lane 1, molecular weight markers (kDa); lane 2, nonreducing conditions; lane 3, reducing conditions

图4. 蛋白斑点杂交分析验证融合蛋白的持续表达及SDS-PAGE分析

Table 2. Comparison of the growth and sTNFRII-gAD fusion protein production of engineered cells in suspension batch and fed-batch cultures

表2. 60 mL批次培养和200 mL及3 L流加培养时工程细胞株生长情况及sTNFRII-gAD-Fc蛋白产量比较

aBCA蛋白测定法检测,b用凝胶密度定量(数据未显示)。

PAGE电泳分析,结果与显示免疫印迹分析的条带位置一致(如图4(b)),说明该收集峰是sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白。

3.5. sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白生物活性鉴定

体外检测了该融合蛋白对TNFα杀伤L929细胞的中和活性。结果表明sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白具有中和TNFα的活性(图5),且其抑制TNFα杀伤L929细胞的活性呈剂量依赖性(p < 0.05)。

4. 讨论

TNFa位于细胞因子免疫网络的中枢环节,参与淋巴细胞的迁移、活化、增殖与分化以及淋巴组织的再生,还可诱发细胞凋亡,调节免疫反应,促进慢性炎症的发生发展等。一旦组织中TNFa浓度过高或TNFa信号的持久激活,将导致机体免疫环境和功能的紊乱,诱发疾病如全身炎症反应综合征、风湿性关节炎、炎性肠病、糖尿病、癌症、同种异体移植排斥、多发硬化症等。TNFa的生物学活性是通过细胞表面特异的受体传递信号的。因而,用其受体中和过剩的TNFa是抗TNFa治疗最直接的策略。TNFa受体分为TNFRI(p55)和TNFRII(p75)两种,在自然状态下,TNFa以同源三聚体的形式结合游离的或跨模型的TNFR从而激活胞内一系列信号转导途径引起相应的生物学效应。只有两个或两个以上的TNFR形成聚

Figure 5. TNFα-neutralizing activity of sTNFRII-gAD-Fc fusion protein in the supernatant of serum-free cultures. All assays were performed in triplicate, with error bars representing the standard error of the mean of the samples (p < 0.05)

图5. sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白对TNFα中和活性的检测

合体才能介导下游信号的传递,单个受体分子则不能传导信号。因此,为了使TNFR与TNFa更好地结合从而发挥拮抗TNFa的活性,我们模拟TNFa同源三聚体的复合物研发了sTNFRII-gAD融合蛋白,其在体内外均显示明显优于sTNFRII-Fc融合蛋白拮抗TNFa的活性 [10] 。但sTNFRII-gAD在制备过程中仍大量以单体蛋白形式存在,故本实验室借助Fc片段形成同源二聚体的效应对sTNFRII-gAD进行了改构,制备了sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白,实现了sTNFRII的二聚体化及多聚体化。虽然没有出现预期的六聚体sTNFRII,但却避免了低亲和力sTNFRII单体的形成。此外,IgG1 Fc结构可延长该融合蛋白在血液循环中的半衰期。

近年来,已发展起来许多制备重组蛋白的表达系统,选择哪种表达系统取决于目的蛋白的天然性质及其用途。其中哺乳动物细胞用于表达外源蛋白越来越受重视,但是其存在着产量低,大规模细胞培养技术不成熟等缺陷。在此,利用富含GC的真核表达载体pMH3在可无血清悬浮生长的CHO-S细胞中表达sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白,其优势是在结构基因和/或基因启动子的5’和/或3’端分别加入了一段非编码的富含GC的DNA片段(包括内含子)。一般染色体的开放性决定真核细胞基因表达水平,研究发现非编码的富含GC的DNA片段(包括内含子)是一种超级“打开染色质元件” [8] ,参与哺乳动物细胞基因表达调控,有利于大幅度提高目的蛋白的表达量。在此,仅经过一轮的单克隆挑选(大约1个月)就通过斑点杂交(dot blot)方法半定量筛选出最高表达量相当于75 μg/mL的单克隆细胞株。随后进行第二、三轮的单克隆挑选筛选出更纯更稳定的高表达株。该方法避免了目前最常使用的、最成熟的哺乳动物细胞表达系统CHO/dhfr-表达系统 [11] [12] 的不足,如通过大量的筛选及目的基因拷贝数的扩增来提高外源蛋白的表达水平,长期使用甲氨蝶呤(MTX)等筛选药物对细胞有一定的毒性且影响下游的蛋白纯化,大大缩短了生物制药的研发周期,减少了劳动力,降低了成本,因而具有更广阔的市场应用价值。

随着哺乳动物细胞培养技术的不断成熟,哺乳动物细胞大规模培养已成为生物制药行业最重要的技术之一,尤其是无血清悬浮培养技术。无血清培养基化学成分明确,杜绝了血清的外源性污染和对细胞的毒性作用,而且使产品易于纯化、回收率高、成本低。然而,当细胞从有血清的状态进入无血清环境时,由于存在代谢转换,会出现细胞生长缓慢甚至细胞死亡的现象,因此,细胞需要在无血清环境中逐渐适应才能高密度悬浮生长 [13] [14] 。尽管本实验选用的CHO-S细胞曾经过无血清培养基B001成功悬浮驯化,但转染、G418筛选及细胞单克隆化的过程均在有血清贴壁生长的情况下进行的,因而仍然需要对挑取的高表达细胞株进行无血清悬浮驯化培养,为后期大规模悬浮培养提供更加稳定高表达的工程细胞株。

细胞无血清悬浮培养包括批次培养、流加培养及灌注培养。批次培养较直观地反映了细胞在生物反应器中的生长及代谢变化,操作简单,但随着培养时间的延长,不断消耗的营养物质及积累的有害代谢产物(如氨、乳酸、甲基乙二醛)可能成为细胞密度、细胞活力及外源蛋白表达的主要限制因素 [15] - [17] 。本实验我们在500 mL摇瓶中进行批次培养观察蛋白的基础分泌表达,蛋白产量约10.0 mg/L,由于营养等的限制,培养条件的转换等原因使得产量远不及单克隆在96孔板中24 h表达量。为解决细胞在批次培养过程中营养限制的问题,保证细胞高密度高活力生长,提高蛋白产量,又选择了流加培养。流加培养易操作、易放大、产量高,应用较为广泛。然而,流加培养效果的好坏直接影响细胞的生长及产品的表达量。我们初步探索了流加培养的工艺,采取逐级放大培养模式,从小规格的摇瓶及转瓶培养逐步扩大到生物反应器中。一般来说,合格的小规模培养工艺可以为大规模生产提供重要的参考,并能解决大规模生产过程中可能出现的一些问题 [18] 。本实验在悬浮流加培养过程中选择了适合CHO-S细胞悬浮生长的无血清培养基B001,同时添加了100 μM次黄嘌呤、16 μM胸腺嘧啶核苷及胰岛素生长因子(IGF)促进细胞生长,添加流加培养基F001以弥补长期培养过程中营养的消耗。选择2.0 × 106 cells/mL的初始接种密度,既能保证细胞高活力,又有利于缩短扩种时间。过早或过晚流加都会极大地影响流加的最终效果。过早流加,细胞的生长虽然不会出现营养不足,但会导致培养体系中营养过剩,增加了培养体系的渗透压,在培养后期有可能会抑制细胞的生长,导致细胞密度及活力下降。因此,当细胞生长进入平台期或产品生产期间歇(每隔24 h或48 h)添加F001,以葡萄糖水平作为流加体积的控制参数,经反馈法控制每日葡萄糖的残余量,使其维持在较低水平2 g/L左右,既能补充培养过程中营养物质的消耗,又保证了细胞高活力。Erika等 [19] 曾报道,由于细胞存在易化运输和高亲和运输两个系统,细胞能在较低的葡萄糖浓度条件下生长。还有研究发现,在连续或间歇的流加培养过程中,将培养体系中葡萄糖的浓度限制在培养体系中较低的范围内,可以使细胞的新陈代谢从高乳酸生产转为低乳酸生产 [20] ,保持细胞的活力及最大生产力。本研究最终在转瓶和生物反应器中完成了流加培养,产量分别为18.3 mg/L和20.5 mg/L,较批次培养有所提高,但是培养时间未得到明显延长,产量同样也没有单克隆在96孔板中培养24 h表达量高。因而,后期仍需进一步优化培养条件以提高产量,如控制合适的转速,尽量减少对细胞的剪切力,生产期适当的降温,低温可以延长细胞有丝分裂的时间,延迟新陈代谢,虽然这对CHO细胞生长有一定抑制性,但却可能提高重组蛋白的特异性表达 [21] [22] 。

本研究成功构建了pMH3-sTNFRII-gAD-Fc表达载体,利用CHO-S细胞系统实现了sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白的快速高效表达,检测到sTNFRII-gAD-Fc在培养上清中以二聚体和多聚体形式表达,获得了高表达(75 μg/mL)单克隆细胞株,且该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。在摇瓶中无血清批次培养和转瓶及生物反应器中流加培养时产量分别为10.0 mg/L、18.3 mg/L和20.5 mg/L,为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。然而,大规模培养条件的优化、产品批次间的稳定性和过程成本的控制仍需要深入细致的研究。

基金项目

国家新药创新重大专项(No. 2009ZX09103-649),浙江省重大科技专项(Nos. 2008C14082,2010C13007),卫生部科研基金(No. 201231029),浙江省教育厅科学基金(No. Y201016528),浙江省卫生高层次创新人才培养工程,浙江省研究生创新科研项目。

文章引用

王彩虹,蔡秦真,杨红枚,马丽莎,高基民,柳 英, (2015) sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白在CHO细胞中的高效表达
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