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Pharmacy Information
Vol.06 No.04(2017), Article ID:22048,6 pages
10.12677/PI.2017.64014

Study on Pharmacodynamics of Human Endostatin Peptide in the Treatment of Rheumatoid Arthritis

Heyu Liu1, Ying Wang2, Jinhui Liu1, Yuanyuan Jiang2, Yan Huang2, Huicheng Li1*

1Harbin Pharmaceutical Group Bioengineering Co., Ltd, Harbin Heilongjiang

2Harbin Pharmaceutical Group R&D Center, Harbin Heilongjiang

*通讯作者。

Received: Aug. 27th, 2017; accepted: Sep. 8th, 2017; published: Sep. 14th, 2017

ABSTRACT

Objective: Study on the efficacy of human endostatin peptide in the treatment of rheumatoid arthritis, and to provide experimental results for the subsequent development of the human endostatin peptide. Method: Using the method of intradermal injection of bovine collagen and complete Freund’s adjuvant into right foot of Lewis rats, to make a model of rheumatoid arthritis. After the administration, by mean of the change of water level, measure all rats’ foot volume, to calculate the difference of foot volume of all the rats (right minus left foot), which can help observe the therapeutic effect of human endothelin peptide. Result: The treatment group had obvious therapeutic effect and significant difference (p < 0.05). Conclusion: Human endostatin peptide has therapeutic effect on rheumatoid arthritis.

Keywords:Human Endostatin Peptide, Rheumatoid Arthritis, Endostatin

人血管内皮抑制肽治疗类风湿性关节炎药效学研究

刘贺煜1，王莹2，刘锦辉1，姜媛媛2，黄炎2，李会成1*

1哈药集团生物工程有限公司，黑龙江 哈尔滨

2哈药集团技术中心，黑龙江 哈尔滨

收稿日期：2017年8月27日；录用日期：2017年9月8日；发布日期：2017年9月14日

摘 要

目的：研究人血管内皮抑制肽治疗类风湿性关节炎的药效，为人血管内皮抑制肽后续开发提供实验结果的支持。方法：使用Lewis大鼠，右后足跖皮内注射牛Ⅱ型胶原蛋白加完全弗氏佐剂的方法，制作类风湿性关节炎模型，给药结束后，通过水位变化的方法测量所有大鼠后脚体积，并计算所有大鼠的后脚体积之差(右脚减左脚)。以此考察人血管内皮抑制肽的治疗效果。结果：给药组具有明显的治疗效果，且具有显著性差异(P < 0.05)。结论：人血管内皮抑制肽具有治疗类风湿性关节炎的作用。

关键词 :人血管内皮抑制肽，类风湿型关节炎，内皮抑素

Copyright © 2017 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

类风湿性关节炎是一种常见的慢性全身自身免疫性疾病。临床表现为疼痛、肌肉疼痛和不规律发热等症状，给患者带来了很大的痛苦。

统计表明，RA在全世界均有发病，平均发病率为1%，而我国患病率为0.3%~0.4% [1] 。因此在我国类风湿关节炎患者人数至少达到了500万之多。如果类风湿型关节炎得不到有效的治疗，随着病情的恶化，甚至会导致残疾。有新闻报道据有关部门统计我国类风湿关节炎的致残率高达7成。

类风湿关节炎，是一种最终可能导致患者残疾的慢性疾病。但由于发病周期漫长，初期症状往往并不引起患者的重视。常规检查时，X射线片无法发现早期手腕关节的滑膜炎、关节周围炎性渗出及早期骨破坏 [2] 。而当患者感觉明显症状而就医时病情已比较严重。随着我国人口寿命的提高，类风湿关节炎这类慢性疾病的发病率也跟着慢慢升高，严重影响了我国人民的健康。

虽然临床上对治疗类风湿型关节炎的期望很大，由于其发病机理不明，目前没有治疗类风湿性关节炎的特效药。常见的药物为免疫抑制剂，也取得了不错的疗效。但免疫抑制剂本身也有可能导致机体免疫力下降，从而引起其他疾病。因此就需要其它作用机理的治疗药物，或是新的辅助治疗药物，在疗效不变或是提升疗效的基础上，降低免疫抑制剂的用量，从而降低使用免疫抑制剂带来的副作用。

内皮抑素是由胶原蛋白XIII羧基末端的184个氨基酸组成的一种内源性血管生成抑素，于1997年由O’Reilly等发现。它能特异性地抑制内皮细胞的增殖和血管的生成 [3] 。

血管生成是类风湿性关节炎(RA)早期滑膜病理改变特征之一，也是产生和维持RA血管翳的主要因素。内皮抑素可特异性抑制新生血管内皮细胞增殖、迁移、诱导其凋亡而发挥抗血管生成作用，应用内皮抑素抑制滑膜新生血管生成可成为治疗RA的一种全新方法。内皮抑素还可通过抑制成纤维样滑膜细胞增殖，促进其凋亡发挥抗RA效应 [4] 。

人血管内皮抑制肽是我公司从哈尔滨医科大学刘兴汉教授引进的项目，它是一种具有30个氨基酸的内皮抑素。

本项目立项时准备开发的适应症为抗肿瘤，为了增加产品的核心竞争力，拟增加类风湿性关节炎的适应症。本次试验设计了体外试验和体内试验，来考察人血管内皮抑制肽是否具有治疗类风湿型关节炎的作用。

2. 体外活性实验

取对数生长期的人脐静脉内皮细胞HUVEC (购于Science-CellTM Research Laboratory)，胰酶消化后用含10% FBS的DMEM培养基制成5 × 104个/ml浓度的细胞悬液，铺于96孔板中，每孔100 μl。置于37℃，CO2培养箱中培养。

第二日，将人血管内皮抑制肽原料冻干粉用无菌去离子水配置成10 mg/ml的溶液，用DMEM稀释为起始浓度3 mg/ml，以后各浓度为倍比稀释的溶液，加入到各孔中。

37℃，5% CO2培养3天，换为含有10% cck-8的DMEM培养基，37℃、5% CO2培养1 h后用酶标仪OD 450 nm读数，测定活性。

将3批供试品进行体外活性测定，活性应在80%~120%之间，结果如表1所示，以批号******01样品活性为100%计算，其他两批样品的活性分别为95.4%和92.8%，符合活性标准。

3. 动物实验

3.1. 材料与方法

3.1.1. 实验动物与饲育环境

雌性Lewis鼠，200 g左右，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2015-0001]。实验场所为本公司(哈药集团生物工程有限公司)实验室[SYXK(黑)2015-008]。60Co灭菌全价颗粒饲料，购于北京科澳协力饲料有限公司[SCXK(京)2014-0010]，饮用水为灭菌水，自由采食。

3.1.2. 实验试剂

牛II型胶原蛋白(CII)、完全弗氏佐剂(CFA)，均购于西格玛公司。

3.2. 实验方法

3.2.1. 类风湿性关节炎大鼠模型的建立

参照张新梅 [5] - [10] 等的方法，进行改进，制定此方案。

将天然牛CII溶于0.01 mol/L醋酸，使终浓度为3 mg/ml，放置冰箱4℃过夜后，加等体积的CFA乳化。将Lewis大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，于右后足跖皮内注射0.1 ml。第21天予以腹腔内注射75 ug牛II型胶原(溶解于0.01 mol/L醋酸中)。

3.2.2. 实验动物分组与给药

造模结束后第2天，将所有大鼠随机分为2组，一组为人血管内皮抑制肽组13只大鼠，腹腔注射人血管内皮抑制肽21 mg；一组为阴性对照组13只大鼠，腹腔注射生理盐水0.5 ml。连续给药7天。

Table 1. Result of biological activity

表1. 活性测定结果

3.2.3. 大鼠脚部肿胀程度的测定

用纯化水将烧杯灌满，再将麻醉后的大鼠后脚深入水中，水溢出后，测量烧杯内剩下水量，计算溢出水的体积，即为大鼠后脚体积。测量所有大鼠后脚体积，并计算所有大鼠的后脚体积之差(右脚减左脚)。

3.3. 统计学方法

应用SPSS18.0对实验数据进行统计分析，结果均使用均数 ± 标准差( X ¯ ± s)，组间差异比较使用秩和检验法，选取α = 0.05。

3.4. 结果

从表2、图1可见，给药组大鼠肿胀程度平均为0.52 ± 0.24，阴性对照组肿胀程度平均为0.78 ± 0.34。人血管内皮抑制肽给药组脚部肿胀程度，明显降低(P < 0.05)。

本次实验方案及实验通过本公司实验动物管理委员会伦理审核。

4. 讨论

本次试验结果表明人血管内皮抑制肽对大鼠脚部肿胀具有明显的抑制作用，且具有显著性差异，充分说明了人血管内皮抑制肽对类风湿性关节炎的治疗作用。后续可以考虑进一步开发类风湿性关节炎的适应症。

本实验所采用的模型为国内外公认的成熟模型，加上类风湿性关节炎也没有公认的特效药，故本实验没有设计阳性对照。

Table 2. The degree of foot swelling in each group of rats

表2. 各组大鼠脚部肿胀程度

注：*表示与对照组比较，*P < 0.05。

Figure 1. The degree of foot swelling in each group of rats

图1. 大鼠脚部肿胀程度

本实验采用了牛II型胶原蛋白(CII)加完全弗氏佐剂(CFA)的方法，它和传统的只使用佐剂的方法不同。虽然类风湿型关节炎发病没有公认的机理，但有一种理论认为是关节腔内的胶原蛋白脱落，掉入关节腔中，引起的一系列的免疫反应。该理论解释了为何免疫抑制剂可以治疗类风湿性关节炎。另外根据这种理论现在有一种疗法，即通过手术治疗类风湿性关节炎，已取得了不错的疗效 [11] 。该疗法也佐证了这一理论。由此可以得出该理论应十分接近于类风湿性关节炎的发病机理。我们采用注射胶原蛋白的方法，来模拟类风湿性关节炎的形成。

实验动物实验部分仅检测大鼠脚部肿胀的体积，并没有在动物实验进行TNF-α等细胞因子 [12] [13] [14] [15] 的检测。体外实验部分开展了作用机理的验证。人血管内皮抑制肽为引进自刘兴汉教授的项目，作用机理方面刘老师开展的很完善，我公司项目组不需要在动物实验部分再重复研究作用机理。

人脐静脉内皮细胞HUVEC是一种国内外公认的内皮细胞。体外实验表明人血管内皮抑制肽对内皮细胞的生长有明显的抑制作用，验证了人血管内皮抑制肽对血管生成的抑制作用。本次体外实验一方面是为了验证人血管内皮抑制肽抑制血管生成的作用机理，另一方面也是为了建立新药研究质量检测体系中体外活性的检测方法。结果表明这两部分实验目的都达到预期。

类风湿性关节炎患者多为中老年。而新生血管在成年人体内不会生成。内皮抑素对血管内皮细胞有抑制作用而对非内皮细胞均无抑制作用；内皮抑素对血管生成有抑制作用而对静止的血管组织不起作用。所以新生血管生成抑制剂本身的副作用非常小。如与免疫抑制剂联合用药，可以降低免疫抑制剂的用量，从而减少免疫抑制剂带来的副作用。本次实验结果充分提示了人血管内皮抑制肽可以做为一种治疗类风湿性关节炎的一种辅助用药。

作为辅助用药，一方面使用免疫抑制剂来直接治疗类风湿型关节炎，同时使用新生血管生成抑制剂，另一方面也可以抑制新的成纤维样滑膜细胞增殖。两者发挥协同作用，进行治疗类风湿性关节炎。以达到减少免疫抑制剂用量，而降低免疫抑制剂带来的免疫力下降的副作用。

人血管内皮抑制肽只有30个氨基酸，既可以使用化学合成也可以使用生物工程的方法制备。目前采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)方法制备。注射液生产中热原一直是质量控制的重点。常见热原为内毒素。内毒素本质是革兰阴性细菌细胞壁上的脂多糖，当细菌裂解或其黏附在其他细胞上时脂多糖可释放出来 [16] 。采用动物细胞发酵制备的生物制品，在生产中不引入内毒素，在控制热原方面优势明显。

药物的制剂主要由主要成分和辅料组成。药物的副作用也主要来自于这两方面。随着制剂学研究的深入，药用辅料的副作用越来越低。药物的副作用渐渐由主要成分占主导。开发主药本身副作用小的药物，则是现代新药开发的重点之一。

人血管内皮抑制肽在作用机理上副作用小，制备工艺又容易控制热原，可以大幅降低在临床应用时的副作用。非常适合用于治疗类风湿性关节炎这种需长期给药的慢性疾病。具有广阔的临床应用前景。

致谢

本课题引进自哈尔滨医科大学刘兴汉教授，刘教授对本课题的研究帮助很大，特此致谢。

文章引用

刘贺煜,王 莹,刘锦辉,姜媛媛,黄 炎,李会成. 人血管内皮抑制肽治疗类风湿性关节炎药效学研究
Study on Pharmacodynamics of Human Endostatin Peptide in the Treatment of Rheumatoid Arthritis[J]. 药物资讯, 2017, 06(04): 84-89. http://dx.doi.org/10.12677/PI.2017.64014

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