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Hans Journal of Ophthalmology
Vol.04 No.02(2015), Article ID:15521,6 pages
10.12677/HJO.2015.42005

The Expression of p21WAF1/CIP1 in Rabbit Proliferative Vitreoretinopathy

Caiyun You1, Zhigang Yuan2, Zheng Zeng1, Hua Yan1*

1Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin

2Shanxi Eye Hospital, Taiyuan Shanxi

Email: *phuayan2000@163.com

Received: May 29th, 2015; accepted: Jun. 23rd, 2015; published: Jun. 26th, 2015

Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

ABSTRACT

Objective: To observe the expression of p21WAF1/CIP1 during the course of experimental proliferative vitreoretinopathy (PVR) in rabbits and analyze its possible mechanism. Method: Thirty- one pigmented rabbits were divided into two groups, experimental group in 28 rabbits and normal control group in 3 rabbits. Histology was used to observe PVR progress. Western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) methods were used to detect the expression of p21WAF1/CIP1, CDK2, cyclin E protein or mRNA in retina on different set points. Results: Inflammatory cells infiltration was observed on day 7 in experimental rabbits’ retina. The proliferative typical strip of local retina was formatted on day 14 and fixed fold was noticed on the retina on day 28. Western blot method showed that the relative expression of p21WAF1/CIP1 protein was lowest on day 14, and the relative expression of CDK2 and cyclin E protein were highest on day 14. The difference with that in other set points had strong statistic significance (F = 20.55, P = 0.00; F = 26.903, P = 0.000; F = 10.00, P = 0.00). RT-PCR method also showed that the lowest relative expression on the relative expression of p21WAF1/CIP1 mRNA was on day 14, and the highest relative expression on the relative expression of CDK2 and cyclin E mRNA were noticed on day 14. The difference had strong statistic significance with that in other groups (F = 18.06, P = 0.00; F = 14.90, P = 0.00; F = 87.64, P = 0.00). Conclusions: The expression of p21WAF1/CIP1 decreased during the course of PVR, which might contribute to the progress of PVR by regulation CDK2 and cyclin E levels.

Keywords:p21WAF1/CIP1, Proliferative Vitreoretinopathy, Animal Model

p21WAF1/CIP1在兔增生性玻璃体视网膜病变 视网膜中的表达

由彩云1，袁志刚2，曾峥1，颜华1*

1天津医科大学总医院，天津

2山西省眼科医院，山西 太原

Email: *phuayan2000@163.com

收稿日期：2015年5月29日；录用日期：2015年6月23日；发布日期：2015年6月26日

摘 要

目的：观察p21WAF1/CIP1在兔增生性玻璃体视网膜病变(PVR)模型中的变化，探讨其在PVR发生发展的可能作用机制。方法：选取青紫蓝兔31只，实验组28只，正常对照组3只，组织病理学检查PVR病变情况，蛋白免疫印迹(Western blot)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时间点视网膜p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E表达情况。结果：实验组7 d组织学检查示视网膜表面炎性细胞聚集，14 d时形成典型局部增殖条索，28 d时形成固定皱褶。Western blot结果显示p21WAF1/CIP1相对表达量14 d时最低；CDK2蛋白及cyclin E蛋白的相对表达量14 d最高，与其他时间点有统计学差异(F = 20.55, P = 0.00; F = 26.903, P = 0.000; F = 10.00, P = 0.00)。RT-PCR结果显示各组p21WAF1/CIP1mRNA的相对表达量14 d时最低；CDK2及cyclin E mRNA的相对表达量14 d最高，与其他时间点差异显著(F = 18.06, P = 0.00; F = 14.90, P = 0.00; F = 87.64, P = 0.00)。结论：p21WAF1/CIP1在PVR表达下降，使PVR病情加重，这一作用可能是通过调节CDK2和cyclin E的表达实现。

关键词 :p21WAF1/CIP1，增生性玻璃体视网膜病变，动物模型

1. 引言

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是孔源性视网膜脱离手术后及开放性眼外伤后严重的并发症，是眼内发生的过度损伤修复过程，由于多种增殖细胞在视网膜表面聚集形成视网膜前膜，牵拉可造成视网膜脱离[1] 。其发病机制仍不十分清楚，而视网膜色素上皮细胞的异常增生是导致PVR发生的重要病理基础。p21WAF1/CIP1是近年来发现的一种细胞周期负性调控基因，参与抑制细胞生长、发育、分化等多种生物学功能，阻止细胞从G1期进入S期，引起细胞周期停止，抑制细胞增殖[2] 。为探讨p21WAF1/CIP1在PVR形成过程中的作用及机制，本实验通过建立PVR动物模型，观察视网膜中p21WAF1/CIP1、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase, CDK)-2、细胞周期蛋白(cyclin)-E蛋白及mRNA水平，探讨p21WAF1/CIP1在PVR发病中的可能作用机制。现将结果报道如下。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

成年青紫蓝兔31只(由天津医科大学动物中心提供)，体重1.5~2.5 kg，雌雄不限，实验组28只，正常对照组3只。实验组每只兔随机选取一只眼作为实验眼。采用参考文献[3] 的方法建立兔PVR动物模型。

2.2. 组织病理学检测

分别于建模后7 d、14 d、21 d、28 d每组随机选取1只兔子，过量麻醉处死后摘出眼球，10%福尔马林浸泡30分钟，用1 ml注射器抽吸部分玻璃体，并向玻璃体腔内注射10%福尔马林约0.5 ml，从内部固定视网膜，24小时后矢状位剖开眼球，剖面穿过视神经，使眼球内部充分浸泡在固定液中，防止视网膜脱离。固定两天后，取出眼球组织，去除眼前节及晶状体，每半只眼球在与剖开面相对的赤道部巩膜开窗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后、包埋制成石蜡标本，对全眼球进行切片。切片厚度5 μm，常规烘片、脱蜡、苏木素伊红(HE)染色、脱水、透明、封固后用光学显微镜观察并照相。

2.3. 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测视网膜p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白表达

过量麻醉处死正常组兔3只，摘除双侧眼球共6只；对于实验组，分别于建模后第7 d、14 d、21 d、28 d过量麻醉处死实验兔，每个时间点6只，每只摘除实验眼。于碎冰上去除眼前节和玻璃体，剥取视网膜组织置入液氮中备用。将标本按1：6加入预冷的组织细胞裂解液，在4℃下充分匀浆。静置1 h后，12,000 r/min × 20 min高速冷冻离心机离心，上清液与蛋白上样缓冲液(Loading Buffer (5×)、Reduce Agent (20×)充分混合，100℃煮沸5 min。Bradford法测定蛋白定量。每泳道上样25 ug，10% SDS-page电泳分离蛋白，以半干法用DYY-III40C型电泳槽将电泳后的凝胶上蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，0.5%脱脂奶粉封闭膜，室温1.5 h后加入兔抗p21WAF1/CIP1抗体(1:200美国Santa Cruz公司)、CDK2鼠单克隆抗体(1:200，上海碧云天公司)、cyclin E鼠单克隆抗体(1:200，上海碧云天公司)，4℃摇床过夜。次日，室温下用山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶(HRP) (1：2000)稀释，孵育1 h，ECL发光剂与膜反应3 min，压片曝光3 min。将胶片进行扫描，采用Quantity One (Bio-Rad)软件，计算不同条带的灰度值(吸光强度×面积)，以β-actin作为内参照，目的蛋白的相对表达量 = (其条带灰度值/内参条带灰度值) × l00%。

2.4. RT-PCR方法检测视网膜p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E mRNA表达水平

采用与Western blot相同的方法获取视网膜标本，Trizol (上海生物工程有限公司产品)提取兔视网膜组织标本总RNA。紫外分光光度计测行RNA260、280 nm处的吸光度[A，旧称光密度(OD)值]，计算出总RNA样体浓度。引物由上海生物工程技术有限公司合成：p21WAF1/CIP1上游引物为5’-GAA CCA TGT TGG GAG TGT-3’，下游引物为5’-ACT GCT TAT TGG TCT TGT G-3’，目的片断长度为321碱基对(bp)；CDK2上游引物为5’-ATC CGC CTG GAC ACT GAG-3’，下游引物为5’-GGT AAG AGT AGC CCA GGA-3’，目的片断长度为269bp；cyclin E上游引物为5’-TTC CAC ACA GGA GCA AAG TAT G-3’，下游引物为5’-TGC AAC TTT GGA GGG TAG ATT T-3’，目的片断长度为377 bp；内参照基因β-actin的上游引物为5’-AGT CGT TGG AGC GAG CAT-3’，下游引物为5’-GTT TAT AGC ACT CTA CGG TAC-3’，目的片断长度为121 bp。常规PCR程序扩增，琼脂糖凝胶中电泳分离，采用凝胶成像分析系统测量目的基因p21WAF1/CIP1及内参β-actin的扩增条带的产物含量。

2.5. 统计分析

实验数据采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。数据结果以均数±标准差()表示，采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学处理，组间两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 组织病理学检查

实验组7 d病理组织学检查示视网膜表面炎性细胞聚集，可见成纤维细胞增生；14 d时视网膜表面增殖，形成典型局部增殖条索，视网膜出现皱褶；28 d时视网膜增生更为明显，视网膜结构紊乱，形成视网膜固定皱褶，可观察到花节样外观。对照组7 d病理组织学检查示视网膜表面炎性细胞及渗出，未见典型成纤维细胞增生；14 d时视网膜表面增殖明显，但仍未形成明显增殖条索；28 d时视网膜结构尚存，视网膜表面形成明显增殖条索(图1)。

3.2. Western blot方法检测视网膜p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白表达

p21WAF1/CIP1蛋白的相对表达量在正常组为0.74 ± 0.08，建模后第7 d、14 d、21 d和28 d分别为0.60 ± 0.05、0.56 ± 0.03、0.74 ± 0.02和0.65 ± 0.04。P21WAF1/CIP1蛋白的相对表达量第14 d时最低，与其他时间点差异有统计学意义(F = 20.55, P = 0.00)。CDK2蛋白的相对表达量在正常组为0.44 ± 0.06，建模后第7 d、14 d、21 d和28 d分别为0.60 ± 0.09、0.71 ± 0.04、0.37 ± 0.09和0.44 ± 0.06。cyclin E蛋白的相对表达量在正常组为0.68 ± 0.09，建模后第7 d、14 d、21 d和28 d分别为0.64 ± 0.08、0.79 ± 0.04、0.66 ± 0.06和0.57 ± 0.04。第14 d时，CDK2蛋白及cyclin E蛋白的相对表达量最高，与其他时间点差异均有统计学意义(F = 26.903, P = 0.000; F = 10.00, P = 0.00) (图2)。

(a) (b) (c) (d) (e) (f)

Figure 1.(a) 实验组7 d视网膜表面炎性细胞聚集，可见成纤维细胞增生HE × 200；(b) 对照组7 d视网膜表面炎性细胞及渗出，未见典型成纤维细胞增生HE ×200；(c) 实验组14 d视网膜表面增殖，形成典型局部增殖条索HE × 200；(d) 对照组14 d视网膜表面增殖明显，但未形成明显增殖条索HE × 200；(e) 实验组28 d视网膜增生明显，视网膜结构紊乱，形成视网膜固定皱褶，呈花节样外观HE × 100；(f) 对照组28 d视网膜表面形成明显增殖条索，视网膜结构尚存HE × 200

图1. HE染色示实验组及对照组兔视网膜病理改变

(a) (b)P21WAF1/CIP1蛋白的相对表达量第14 d时最低，与其他时间点差异有统计学意义；第14 d时，CDK2蛋白及cyclin E蛋白的相对表达量最高，与其他时间点差异均有统计学意义

Figure 2. Protein (a) and its the relative expression (b) of p21WAF1/CIP1, CDK2, and cyclin E in proliferative retina on experimental and control group were examined by western blot (n = 6)

图2. Western blot检测实验组及对照组增生视网膜p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白的表达(a)及相对表达量(b) (n = 6)

P21WAF1/CIP1 mRNA的相对表达量第14 d时最低，与其他时间点差异有统计学意义；第14 d时，CDK2及cyclin E mRNA的相对表达量最高，与其他时间点差异均有统计学意义

Figure 3. mRNA (1,3,5) and its relative expression (2,4,6) of p21WAF1/CIP1, CDK2 and cyclin E in proliferative retina on experimental and control group were examined by RT-PCR analysis (n = 6)

图3. RT-PCR检测实验组及对照组增生视网膜p21WAF1/CIP1、CDK2与cyclin E mRNA的表达(1,3,5)及其相对表达量(2,4,6) (n = 6)

3.3. RT-PCR法检测视网膜p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E mRNA的表达

图3(a)显示p21WAF1/CIP1与β-actin在兔正常视网膜及建模后不同时间点视网膜的mRNA扩增产物电

泳结果。各组p21WAF1/CIP1mRNA的相对表达量，正常组为0.65 ± 0.09，建模后第7 d、14 d、21 d和28 d分别为0.57 ± 0.05、0.45 ± 0.04、0.46 ± 0.02和0.47 ± 0.04，第14 d时p21WAF1/CIP1 mRNA的相对表达量最低，与其他时间点差异有统计学意义(F = 18.06, P = 0.00) (图3(b))。图3(c)显示CDK2与β-actin在兔正常视网膜及建模后不同时间点视网膜的mRNA扩增产物电泳结果。正常组CDK2 mRNA的相对表达量为0.52 ± 0.06，建模后第7 d、14 d、21 d和28 d分别为0.59 ± 0.09、0.76 ± 0.04、0.73 ± 0.09和0.72 ± 0.06。图3(e)显示cyclin E与β-actin 在兔正常视网膜及建模后不同时间点视网膜的mRNA扩增产物电泳结果。正常组cyclin E mRNA的相对表达量为0.68 ± 0.09，建模后第7 d、14 d、21 d和28 d分别为0.76 ± 0.08、1.22 ± 0.04、1.15 ± 0.06和0.99 ± 0.04。第14 d时CDK2 mRNA(图3(d))及cyclin E mRNA(图3(f))的相对表达量最高，与其他时间点差异有统计学意义(F = 14.90, P = 0.00; F = 87.64, P = 0.00)。

4. 讨论

PVR是在孔源性视网膜脱离和眼球穿孔伤后的机体自我修复过程，是眼的一种增生性反应。其发病机制目前尚不十分清楚。目前研究认为，PVR的发生与有多种细胞因子有关，这些因子刺激视网膜色素上皮细胞、神经胶质细胞及成纤维细胞等在视网膜表面及玻璃体内增生，参与增殖膜形成，促进膜收缩，导致视网膜脱离。

细胞进入细胞周期后由于受到各种机制的共同调控，保证了细胞按顺序经历各个事件，细胞完成正确分裂[4] ，细胞增殖发生。近年来研究发现细胞周期调控蛋白主要包括以下几类：cyclins、CDK和细胞周期依赖性激酶抑制剂(cyclindependent kinase inhibitor, CKI)。当细胞周期调节机制发生改变时将可能导致细胞增殖失控，引起肿瘤等以细胞增殖为特征的疾病。目前发现G1/S期检测点在细胞周期调控中起着比较重要的作用[5] ，而且起作用的主要调节因子是CDK2，激活或者抑制CDK2可以调控细胞的增殖[6] 。

p21WAF1/CIP1是目前已知的cyclin与CDK复合物的广泛抑制剂，它通过依赖和非依赖p53途径，对细胞内信号和细胞外信号做出反应，参与细胞生长、发育、分化、衰老及DNA损伤修复等多种功能[7] [8] 。p21WAF1/CIP1能阻止细胞从G1期进入S期，引起细胞周期停止，抑制细胞增殖[9] 。近年来的研究还发现，在TGF、TNF-α、干扰素-β等因素的作用下，p21WAF1/CIP1基因可以脱离P53的作用快速发生反应，使受损的细胞发生G1期的细胞周期阻滞，防止异常细胞的增殖，称非P53依赖性激活途径[8] [10] 。另外，p21WAF1/CIP1通过与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)结合，抑制PCNA与DNA聚合酶δ结合，阻断DNA正常复制过程，使细胞增殖减缓[11] 。Faria等[12] 研究抑癌基因p53、p21WAF1/CIP1及p27KIP1在星形细胞瘤中表达水平时发现，随着肿瘤恶性程度的增高，p21WAF1/CIP1呈低表达。赵成等[13] 对视网膜母细胞瘤p21WAF1/CIP1表达研究中也发现p21WAF1/CIP1在视网膜母细胞瘤中的表达明显低于正常视网膜组织。以上研究均表明，p21WAF1/CIP1低表达可能为异常增殖性疾病的发病机制之一。

本实验通过建立PVR动物模型，检测p21WAF1/CIP1在PVR视网膜组织中表达，探讨p21WAF1/CIP1在PVR发生发展的变化及其可能的作用机制。结果显示p21WAF1/CIP1在正常组有一定量的表达，实验组表达降低，且在建模后第14 d时表达最低。分析其原因，在正常组有一定量的p21WAF1/CIP1表达，可以使视网膜细胞处于一个增殖及抑制的平衡状态，既保证细胞新旧更迭，维持一定量的细胞进入正常细胞周期进行分裂增殖，又可防止无序的细胞增殖，产生肿瘤等以增殖为特征的疾病。建模后最初7d，在各种炎性因子及细胞活性物质的作用下，p21WAF1/CIP1表达有所下调，为细胞的增殖做准备，在大体病变可发现视网膜炎性细胞浸润与细胞增生的早期表现。在建模后第14 d，可检测到p21WAF1/CIP1弱表达，而此期正是视网膜前膜及各种增殖细胞快速增殖的时期，p21WAF1/CIP1作为细胞增殖抑制因子，其蛋白及基因水平在这一时期表现为弱表达，有利于增殖细胞的生长，与其生物学功能一致，细胞性前膜开始形成并有收缩牵拉的表现，临床上PVR患者在此时如施行手术，可看到典型PVR改变[14] ，此时是施行手术的最佳时机。在建模后第21 d和28 d，p21WAF1/CIP表达有所回升，但仍低于正常水平，病理学检查可见细胞增殖进一步加重，表现为视网膜增殖，膜的收缩引起视网膜不规则皱褶牵拉视网膜，临床上此期也可观察到PVR患者形成漏斗状视网膜脱离，此时手术不仅难度增大，而且手术后效果欠佳[15] 。而CDK2和cyclin E作为p21WAF1/CIP的下游蛋白及细胞周期的正性调节蛋白，在PVR整个病程中其蛋白及mRNA表达与p21WAF1/CIP正好相反，随着病程延长，表达量逐渐升高，至14 d时表达最高，之后略有下降，但仍高于正常水平。

因此，根据以上结果我们认为p21WAF1/CIP可能是PVR病程进展中起关键作用的调控因子，由于其低表达，引起下游CDK2、cyclin E的高表达，从而使病变程度进一步加重。p21WAF1/CIP在建模后第14 d表达最低，之后逐渐升高，但仍维持在一个较低的水平，对细胞增殖的调控可能是通过对下游蛋白CDK2、cyclin E的调控来实现的。

基金项目

本文由天津市应用基础与前沿技术研究计划(12JCYBJC33900)基金项目支持。

文章引用

由彩云,袁志刚,曾 峥,颜 华, (2015) p21WAF1/CIP1在兔增生性玻璃体视网膜病变视网膜中的表达
The Expression of p21WAF1/CIP1in Rabbit Proliferative Vitreoretinopathy. 眼科学,02,27-33. doi: 10.12677/HJO.2015.42005

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