Botanical Research
Vol.1 No.3(2012), Article ID:5041,5 pages DOI:10.4236/BR.2012.13009
Optimization of Chaenomeles SRAP-PCR Reaction System through the Quadratic Orthogonal Rotatable Combinatorial Design*
Forestry College, Shandong Agricultural University, Tai’an
Email: zangdk@sdau.edu.cn
Received: Aug. 31st, 2012; revised: Sep. 14th, 2012; accepted: Sep. 15th, 2012
ABSTRACT：
Using Chaenomeles genome DNA as template, the relationship between the five PCR factors (Mg2+, dNTP, primer, Taq DNA polymerase, template DNA) and the PCR results was studied through the quadratic orthogonal rotatable combinatorial design. The mathematical model of the PCR result on the PCR factors was firstly established by software SAS9.0. Based on the model, the optimized amplification system for SRAP-PCR of Chaenomeles was set up and verified. The successful establishment of the optimization system showed that the quadratic orthogonal rotatable combinatorial design are stable and reliable to optimize the SRAP-PCR system, and it could be applied to the other optimization of PCR systems.
Keywords: Chaenomeles; Quadratic Orthogonal Rotatable Combinatorial Design; Optimization of PCR System; Mathematical Model
利用二次正交旋转组合设计优化木瓜SRAP-PCR反应体系*
臧德奎，尹长虹，王延玲，马 燕
山东农业大学林学院，泰安
Email: zangdk@sdau.edu.cn
摘 要：
以木瓜属(Chaenomeles)植物基因组DNA为模板，采用五因素二次正交旋转组合设计(
实施)，对PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)进行研究，首次建立了PCR反应的各因素编码值与PCR结果评分值之间的数学模型。利用该模型，建立了PCR反应的最优体系，并进行了验证。最优体系的成功建立表明，该优化方法是稳定可靠的，可以为其他物种的PCR体系优化提供借鉴。
收稿日期：2012年8月31日；修回日期：2012年9月14日；录用日期：2012年9月15日
关键词：木瓜属；二次正交旋转组合设计；PCR体系优化；数学模型
1. 引言
相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是由加州大学的Li和Quiros在芸薹属(Brassica)植物上开发出来的、基于PCR的新型分子标记系统[1]。该标记针对基因外显子中GC含量丰富、启动子和内含子中TC含量丰富的特点，设计独特的引物对开放阅读框ORFs进行特异扩增，具有简单、快速、稳定性强、无需预知序列信息、在基因组中分布均匀等特点，现已广泛应用于甜瓜、桃、柿子、牡丹、番茄、葱属等多种植物的遗传多样性评价、品种鉴定、比较基因组学等诸多领域[2-14]，均取得了很好的结果。
SRAP是基于PCR反应的分子标记，其反应条件受到PCR各因子的浓度、模板质量、退火温度等多种因素影响，SRAP-PCR反应体系的建立和优化是试验成功与否的关键。目前，优化PCR反应体系的方法主要有正交试验法和单因素试验法。正交试验法只是选择了设计组合中较好的一个，最优组合不一定出现在正交设计表中；单因素试验法则依次选择了各组分的最佳浓度，但不能反映PCR体系中各组分的交互作用，因此也无法确保该组合为最佳反应体系。此外，均匀设计法[15]、趋势面设计法[16]也偶尔用于PCR体系优化，但均不能明确反映PCR各因素间及其与PCR结果间的函数关系。
二次正交旋转组合设计是正交回归试验设计的一种，它克服了普通正交设计无法寻找最优区域的缺点，同时又保留了正交设计试验次数少、计算简便、消除回归系数间相关性的优点。而且，利用该设计还可以建立定量数学模型，并从多角度对模型进行模拟分析。二次正交旋转组合设计目前主要应用于机械工艺研究、培养基组份优化以及田间施肥量试验[17-24]，尚无用于筛选PCR反应体系的报道。本研究首次尝试采用二次正交旋转组合设计优化SRAP-PCR反应体系，并对其进行建模分析，以期得到最佳反应组合。
2. 材料与方法
2.1. 材料
研究材料为木瓜属(Chaenomeles)植物的叶片，采自山东农业大学校园，包括“豆青”(C. sinensis “Douqing”)、“长俊”(C. cathayensis “Changjun”)和“多彩”(C. speciosa “Toyo-Nishiki”)3个品种。
SRAP引物参照王明明等[25]的引物组合，正向序列为：5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’，反向序列为：5’-GACTGCGTACGAATTTAG-3’。
Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DNA marker购自Biomiga公司，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.2. 研究方法
2.2.1. 木瓜基因组DNA的提取和检测
以木瓜幼叶为材料，利用改良CTAB法[26,27]提取基因组DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计法检测DNA质量和纯度，稀释至50 ng·μL–1，–20℃保存。
2.2.2. PCR反应体系的二次正交旋转组合设计
采用5因子二次正交旋转组合设计(
实施)。以PCR反应体系中的5个因子Mg2+(X1)、dNTP(X2)、引物(X3)、Taq DNA聚合酶(X4)、模板DNA(X5)为自变量，编制PCR反应的因子水平编码表(表1)。反应体系总体积为25 μL，不足体积用ddH2O补充。试验设计方案见表2，共36个处理，每个处理4次重复。
PCR扩增程序参照文献[1]：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸7 min。
扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭(EB)染色，在凝胶成像系统上采集图像。
Table 1. Factor levels and their coded values
表1. PCR反应的因子水平编码表
Table 2. Experimental matrix and results
表2. 试验设计矩阵及试验结果
3. 结果与分析
3.1. 回归模型的建立
木瓜SRAP-PCR反应体系的36个处理的扩增结果(图1)显示，不同处理间存在显著差异。目前对电泳图的评价主要采用评分法[28]，本研究加以改进。对凝胶成像图中36个处理，除了统计亮度高且清晰的条带数量外，还根据4次重复实验计算同一处理的方差
注：M为DNA marker，1~36为二次正交旋转组合试验设计不同的处理。 Note: M means DNA marker, 1 - 36 means different treatments of the experiment. This figure is one of the four repeated experimental pictures.
Figure 1. Electrophoresis photograph of SRAP-PCR reaction with the quadratic orthogonal rotatable combinatorial design
图1. SRAP-PCR二次正交旋转组合试验设计电泳图
以反映其稳定性。依不同处理的条带总数与方差进行排序，条带最多且方差较小的处理得36分，条带最少且方差较大的处理得1分，以此类推，以不同处理所得分值为目标函数(表2)。
将表2中的试验设计矩阵及评分结果在SAS 9.0软件中运行，由响应面的参数估计得回归方程：
Y = 23.6875 – 5.791667X1 + 4.875X2 + 2.625X3 + 7.208333X 4 + 2.041667X5 – 1.28125X12 – 2.5625X1X2 – 0.78125X22 + 0.1875X1X3 + 1.6875X2X3 – 1.90625X32 – 0.4375X1X4 + 0.0625X2X4 – 0.9375X3X4 – 1.15625X42 – 1.4375X1X5 + 1.5625X2X5 + 1.5625X3X5 – 0.5625X4X5 – 2.65625X52
该方程反映了PCR处理的评分值Y与PCR各因素编码值之间的函数关系。
回归模型的方差分析(表3)显示，除交叉项外，方程的线性项、平方项及总回归全部显著，复决定系数R2 = 0.9342，证明回归方程与实际拟合较好；失拟检验不显著(P = 0.7118)，说明未知因素对试验结果的干扰较小，因此回归模型有意义。
3.2. 木瓜SRAP-PCR反应最优体系的建立与验证
3.2.1. 最优体系的建立
将回归方程代入SAS9.0，在各因素编码范围(–2~2)内的0.1水平上进行模拟寻优，求得Y的极大值点。此时X1 = –2，X2 = 2，X3 = 1.72，X4 = 2，X5 = 1.81，Y = 68.3045。
将各因子编码值换算为相应的浓度值即得到反应的最优体系：Mg2+ 1.5 mmol·L–1、dNTP 0.4 mmol·L–1、引物0.379 μmol·L–1、Taq DNA聚合酶2 U、模板DNA 67.15 ng，总体积为25 μL。
3.2.2. 利用最优体系筛选多态性引物组合
以木瓜属3个品种的基因组DNA为模板，利用上述最优体系对157对SRAP引物(表4)进行扩增(图2)，共筛选出条带清晰且多态性丰富的引物组合32对，这32对引物共扩增出544条带，其中多态性条带495条，平均每对引物扩增出15.47个多态性条带。可以看出，该最优体系对不同木瓜品种及引物组合的扩增均是稳定可靠的。
4. 讨论
PCR技术在各个领域都有着广泛应用，PCR反应体系因参试物种、分子标记方法及药品质量的不同而有所差异，但PCR的优化方法是可以通用的，因此，选择一个好的试验设计方法对PCR体系的优化至关重要。
本文运用二次正交旋转组合设计优化木瓜的SRAP-PCR反应体系，建立了PCR处理的评分值与PCR各因素编码值之间的数学模型，该模型达到了0.0001的极显著水平且失拟检验不显著，即所建模型有意义且与实际拟合较好，因此该设计方法是合适的。
目前对电泳胶图的评价主要采用直观法，对其进行评分分析的较少且均未体现出条带的稳定性[16, 29,30]。本实验采用条带数之和与方差相结合的方法，既体现了条带的特异性和敏感性，又兼顾其稳定性。模型的成功建立证明该评价方法是可行的。
Table 3. Variance analysis of the regression model
表3. 回归模型的的方差分析
Table 4. SRAP primer sequences used in amplification
表4. 用于扩增的SRAP引物序列
Note: M means DNA marker, 83 - 92 means different primer combinations.
注：M为DNA marker，83~92为不同引物组合的序号。
Figure 2. Amplification results of different primer combinations using the optimized system
图2. 最优体系在部分SRAP引物组合中的扩增结果
所建立的最优体系为Mg2+ 1.5 mmol·L–1、dNTP 0.4 mmol·L–1、引物0.379 μmol·L–1、Taq DNA聚合酶2 U、模板DNA 67.15 ng，总体积为25 μL。利用该最优体系对木瓜属3个种的157对SRAP引物进行筛选，结果表明，该体系对不同木瓜品种及引物组合的扩增均是稳定可靠的，可以用于木瓜属分子研究的后续试验。
将相关文章中的SRAP体系各因素浓度进行编码后带入本实验所得模型，有的体系得分较高，如姜帆等对龙眼的优化体系[31]得分95.90；有的体系得分与本实验相近，如李艳香等对八仙花的优化体系[32]得分62.13；也有的体系得分较低，如楚爱香等对观赏海棠的优化体系[33]得分3.09。这可能是由于不同试验材料对PCR反应体系的要求不一样，因此，所得模型也不能完全通用，需要根据不同的试验材料建立相适应的数学模型进行优化。
二次正交旋转组合设计在PCR体系优化中的应用还没有报道，将该设计方法与SRAP标记技术结合并应用到木瓜属植物的研究中也尚属首例。本文对二次正交旋转组合设计在PCR反应体系优化中的应用进行了尝试，并与SAS软件结合，建立了完整的优化程序，希望能使这项技术在今后PCR体系优化中发挥作用。
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NOTES
*基金项目：国家自然科学基金(30972406)。