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1. 引言

表皮生长因子受体EGFR属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase: RTK)，该家族包括4个成员(称为ErbB或HER家族)，分别是EGFR(ErbB1/HE R1)、ErbB2(Neu/HER2)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HE R4)。其中EGFR最早被克隆，研究得最为充分。本文首先介绍EGFR的生理功能及其在癌症研究中的重要意义。然后总结近年来对EGFR的结构解析取得的成果，在此基础上讨论高分辨率结构信息对解释EGFR的功能所起到的不可替代的作用。本文的另外一个重点是关于EGFR的计算机模拟研究，包括配体与受体的结合，以及配体诱导的EGFR二聚过程中发生的大尺度构象变化，等等。我们希望读者能了解基于结构的计算机模拟方法和技术在研究包括EGFR在内的生物大分子动态过程方面的应用潜力。最后，我们对EGFR相关的结构生物学和计算生物学研究做出展望。

2. 表皮生长因子受体的功能

EGFR是位于细胞表面的受体，可以结合特异的配体，主要包括表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α (transforming growth factor α: TGFα)，而被激活。当结合配体后，EGFR单体发生二聚化，刺激其胞内酪氨酸激酶(tyrosine kinase: TK)活性，导致C端的一些酪氨酸残基(包括Y992，Y1045，Y1068，Y1148和Y1173)自磷酸化。下游的信号蛋白通过自身SH2结构域与磷酸化的酪氨酸相互作用，从而激活下游信号通路(主要包括MAPK、Akt和JNK通路)，引起级联放大效应。EGFR调节细胞的增殖、分化与迁移，对人体皮肤的天然免疫反应非常重要。

癌症的发生通常与细胞非正常增殖有关，现已发现人体多种癌症的发展都与EGFR的突变或过量表达密切相关。EGFR及其配体表达水平的升高已被认为是多种癌症的一般表现，并且有可能促进固体瘤的生长。Nicholson等研究了1985~2000年间PubMed上的文献，分析EGFR的表达和癌症预报之间的关系^[1]。他们发现EGFR可在头部、颈部、卵巢、子宫颈、膀胱、食道癌的发生中作为有效的指示分子，在这些癌症中，上升的EGFR表达与复发率增加，以及存活率的减少有70%的关联。

因此，EGFR是当前研究抗癌分子治疗的主要靶点之一，EGFR信号通路也已成为研究得最为广泛的信号转导网络。全面透彻地理解EGFR的激活机制对发展新的癌症治疗方法具有重要的意义。有研究团队发现一些癌症治疗药物的敏感性和抗药性与EGFR的突变有关^[2]，对这些突变体的研究将帮助我们寻找更有效的抗癌药物。近年来，利用结构生物学的手段解析EGFR的高分辨率结构取得了重要进展，使我们可以更深入地了解EGFR激活的分子机理，研究EGFR突变对其结构的改变以及对抗癌药物分子的敏感性和抗药性的影响。

3. 表皮生长因子受体的结构生物学研究

人的全长EGFR有1186个氨基酸，由胞外区(extracellular region，氨基酸序列1-620)，单一的跨膜域(transmembrane domain, 621-643)，胞内的近膜区(juxtamembrane region, 644-685)，酪氨酸激酶域(tyrosine kinase domain, 686-953)和一个长的柔性很大的C端调控区(C-terminal regulatory region，954-1186)组成。胞外区由4个结构域(I-IV)组成，通常也称为L1，CR1，L2和CR2或者L1，S1，L2和S2。结构域I(1-165)和结构域III(311-480)有37%的序列相似性，而结构域II(166-310)和结构域IV(481-620)富含半胱氨酸。

由于EGFR是一个分子量较大的跨膜蛋白，且局部结构柔性较大，所以目前还没有获得全长EGFR的晶体结构。现有PDB中已公布的EGFR相关结构都只包含全长的一部分，即EGFR的胞外区结构和胞内酪氨酸激酶区结构。这两个区域的结构都有非激活(图1)和激活(图2)两种状态。

3.1. EGFR胞外区的结构

在EGFR胞外区(soluble extracellular region of EGFR: sEGFR)结构未获得解析之前，人们对配体(EGF或TGFα)诱导的EGFR二聚化方式并不清楚。绝大多数RTKs，如血小板衍生生长因子(PDGF)/Kit 受体家族，配体自身是二聚化的，并使受体有效地交联成二聚复合物。对纤维生长因子(FGF)受体，附属分子使配体连结产生二价的复合物，然后使两个受体分子交联。2002年Cell同期发表的两篇文章，分别解析了sEGFR∙EGF和sEGFR∙TGFα的二聚体晶体结构，彻底改变了人们对配体诱导的EGFR二聚化机制的认识^[3,4]。从这些结构可以看出(图2)，sEGFR的结构域I~III成C型的排列，配体结合在结构域I和III之间，其结合位点和二聚的界面相隔一定距离因而对二聚无直接的贡献。二聚的界面是通过受体的结构域II维

图1. EGFR胞外区和胞内酪氨酸激酶区非激活态构象

系的。在结构域II里一个β发卡结构，也称聚合臂(dimerization arm)，两个EGFR的聚合臂有很强的相互作用，其尖端甚至与对面EGFR分子的结构域I产生作用。

Ferguson等解析了一个sEGFR非激活的晶体结构^[5]，他们发现sEGFR非激活态是一个自抑制的结构：其聚合臂因和结构域IV作用(称为tethered interactions)而被包埋在分子内，而无法形成二聚体(图1)。通过与sEGFR的激活构象比较，可以看出其在被激活前后发生了大尺度的构象变化。结构域I需要有大约130˚的转动以及20 Å的平动，sEGFR才能从非激活态(tethered conformation)转变成激活态(extended conformation)。构象变化导致的主要后果是tethered interactions被破坏，以及二聚臂的暴露，从而使二聚变得可能。但是上述构象变化是如何发生的，以及

图2. EGFR胞外区和胞内酪氨酸激酶区激活态二聚体构象

配体分子在其中所起的作用，现在仍然不清楚。

关于结构域IV在EGFR二聚中所起的作用，有人认为其对sEGFR二聚体的稳定有直接的贡献^[5,6]。但有实验发现，就算将整个结构域IV去除，对二聚体的结合强度影响甚微^[7]。2010年，Lu等解析了包括结构域IV在内的sEGFR二聚体的晶体结构^[8]，表明两个单体的结构域IV之间存在一个小的疏水接触面(图2)，但是其对二聚的贡献尚待进一步研究。

PDB中的EGFR相关结构绝大部分都是人源的，其胞外区二聚体表现出对称性。2010年Lemmon研究组解析了果蝇的2:2 sEGFR∙EGF晶体结构^[9]，发现两个sEGFR单体在结构上是非对称的，他们认为这是EGFR与配体结合负协同性的结构基础，即一个配体与EGFR结合后的构象变化会造成一个非对称的二聚受体，导致配体与剩下的一个结合位点亲和力减弱。

3.2. EGFR胞内酪氨酸激酶区的结构

结合拉帕替尼(lapatinib)的EGFR-TK和结合AMP-PNP的EGFR-TK结构呈现出非活化状态^[10,11]，具有明显的分子内自抑制相互作用。两个结构非常相似而且与蛋白激酶CDKs和Src家族激酶也很像。在这两个结构中，activation loop(A-loop)中一个短的螺旋区紧靠起关键催化作用的C-helix(图1)。在非活化的EGFR-TK、CDK和Src-家族激酶里，C-helix通过与A-loop的相互作用而发生移动，破坏二者之间相互作用的突变可以导致EGFR-TK活化。

活化的EGFR-TK晶体结构是以不对称的二聚体形式存在的^[11]。一个EGFR-TK分子的C-lobe紧靠着与它二聚的另一分子的N-lobe，导致在非活化构象中存在的C-helix和A-loop间的自抑制相互作用在活化的EGFR-TK二聚体中被破坏(图2)。设计能打破不对称二聚体的突变可以阻断EGF对EGFR的激活。在A-loop中有一个保守的谷氨酸残基E738，它与赖氨酸K721形成盐键(图2)，而在非活化的EGFR-TK中，该盐键不存在(图1)。

目前的观点认为EGFR-TK非对称二聚体激酶区活化的机理如下：二体中一个EGFR-TK是activator，而另外一个是receiver。Receiver分子的N-lobe与activator分子的C-lobe相互作用，导致前者被激活，从而磷酸化activator分子C端调控区的酪氨酸。然后两个EGFR互换角色，最终使两个受体分子的胞内C端都完成磷酸化。

综合上述结构信息，可以对EGFR活化的大致过程描绘如下：在未结合配体时，EGFR的胞外区和胞内酪氨酸激酶区都以自抑制的构象形式存在。配体的结合引起受体胞外区的二聚化，使胞内区的距离拉近，导致酪氨酸激酶区形成一个不对称的二聚体。该二聚体能通过别构调节使激酶区活化，从而使两个胞内C端区域的酪氨酸磷酸化^[12]。

虽然迄今已有很多EGFR的结构，但一些重要区段还是很匮乏的。如可能有重要调控功能的胞内近膜区的前30个氨基酸，以及含有多个酪氨酸磷酸化位点的C端190个氨基酸残基与受体激活的调控相关，但有关的结构信息很少。

4. 表皮生长因子受体的计算生物学研究

虽然EGFR的结构信息已非常丰富，但单从这些静态结构我们还不能得知其行使功能时的动态变化。分子动力学(molecular dynamics: MD)模拟是研究在生理条件下生物大分子运动的有效手段，它非常适合于揭示三级、四级结构的变化及其与相应生物功能的关系。虽然EGFR的分子量较大，但随着近年来计算机硬件软件的飞速发展，对其进行MD模拟还是可以实现的。因为EGFR的胞外区和胞内酪氨酸激酶区结构信息最为丰富，目前有关EGFR的MD模拟均集中在这两个区域。

4.1. EGFR胞外区的模拟

Kästner等用MD模拟研究了EGFR胞外二聚体的空间取向、构象可塑性，以及高聚的情况^[13]。与EGFR二聚体立于细胞膜上的传统的结构图不同，他们发现二聚体仅需有限的重排，即可几乎平躺在细胞膜上，这和由荧光共振能量转移(FRET)和电镜实验得到的结果一致。与细胞膜的相互作用引起EGFR二聚体的构象的改变，进而稳定结合界面的联系。他们还模拟了二聚体间的相互作用：在细胞膜上，两个二聚体能通过一个“头对头”(head-to-head)界面形成一个四聚体，其中涉及到胞外区的配体结合位点，增强了配体的结合。在晶体结构中，“头对头”的界面也被发现，但其在模拟中明显更加稳定。

与果蝇sEGFR二聚体的不对称结构相比，人源sEGFR二聚体是对称结构，其负协同性效应只在全长EGFR中才存在。Tynan等基于定量FRET成像的方法，结合蒙特卡洛和MD模拟，以探测EGFR的构象^[14]。他们发现人的具有高配体结合能力的sEGFR构象是平躺在细胞膜上的。通过进一步研究这种构象与配体结合的负协同性间的联系，发现该结构的不对称性与果蝇sEGFR的主要特点很相似。也就是说，从无脊椎动物到人的EGFR负协同性的结构基础都是保守的，但人源EGFR胞外区的不对称还需要与细胞膜的相互作用来维持。

我们对sEGFR3-512(即结构域IV缺失)二聚体在溶液和结晶环境下进行了MD模拟^[15]。在水溶液中，经过纳秒时间尺度的模拟后，sEGFR的结构变得更加紧凑，出现二体对称性的消失以及两个sEGFR单体间有更多的接触。而在晶体环境下的模拟，由于晶格堆积作用使上述构象变化受到抑制。在模拟中缺失的结构域IV可能做为一个spacer，起到稳定二聚体的作用。

4.2. EGFR胞内酪氨酸激酶区的模拟

Papakyriakou等对EGFR-TK的非活化和活化的结构进行了常规的MD模拟，然后利用targeted MD(TMD)模拟两种状态之间的构象转变^[16]。通过模拟他们发现EGFR-TK的二聚可以稳定那些与其活化态相关的结构要素，并且预言了新的有activation loop参与的盐键。EGFR-TK两种状态相互转化的TMD模拟证实了那些具有重要功能的保守结构区域的形成。对一个致癌突变体L834R的模拟揭示了其导致EGFR激活的可能结构基础：1) 突变的R834残基与邻近酸性氨基酸残基形成盐键；2) 导致非活化状态下的一个疏水簇不稳定。

Shan等对野生型EGFR-TK及其突变体进行了微秒时间尺度的MD模拟，发现野生型EGFR-TK的N-lobe二聚界面呈现无序状态，但在形成二聚体后变得有序^[17]。作者认为一些在该区域与癌症相关的突变(特别是L834R)，降低了该区域的无序性从而促进EGFR的二聚。他们还发现在EGFR-TK区的Tyr845的磷酸化可抑制其固有的无序性，这一研究成果为EGFR自发信号转导机制提出了一种模型。

5. 展望

虽然当前EGFR的结构信息已相当丰富，但其激活的很多细节仍不太清楚，有许多尚未完成而又有重要意义的工作，需要更多结构生物学和计算生物学的研究对EGFR的活化机制进行补充验证。例如，我们需要解析全长EGFR(包括单体和二聚体)尽可能完整的结构，特别是胞内近膜区和C端调控区的结构信息。从分子模拟的角度，可以进行以下工作：1) 模拟配体诱导的EGFR胞外区从自抑制构象到伸展构象的转变路径；2) 全长EGFR的多尺度模拟。我们可以根据目前已有的结构，结合同源建模等方法构建全长EGFR的结构模型。然后利用多尺度计算机模拟方法(包括原子水平的MD、粗粒化模拟等)，研究EGFR激活的动态变化过程，在此基础上探讨其参与细胞信号转导的分子机理。

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NOTES

^*资助信息：安徽省自然科学基金面上项目1208085MC38；高等学校博士学科点专项科研基金(新教师类)20113402120013。