ABSTRACT

Objective: To optimize the extract process of paeonol from the roots of Paeonia suffruticosa Andrews adopted by response surface method basing on Box-Behnken design. Method: According to the results of the single factor experiment, a three-factor and three-level Box-Behnken central composite design coupled with response surface analysis (RSM) was employed to evaluate the influence of ethanol concentration, extract temperature and time on extract yield of paeonol. Result: The best extract condition was that 77.5% ethanol (V/V) extracted the crude powder of the root of Paeonia suffruticosa Andrewsat 50˚C for 2 h, solid/liquid ratio 30:1 (mL/g), 92.3% extract yield was obtained. Conclusion: The extract process of paeonolis stable and available for further industrial application.

Keywords:Response Surface, Paeonol, Optimization, Extract Process

基于Box-Behnken设计–响应曲面法优化丹皮酚的提取工艺

杨桐

重庆市璧山来凤中学校，重庆

收稿日期：2018年3月1日；录用日期：2018年3月14日；发布日期：2018年3月21日

摘 要

目的：基于Box-Behnken设计–响应曲面法优化丹皮酚的提取工艺。方法：根据单因素实验数据，选择乙醇浓度(体积分数)、提取温度和提取时间，进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计，采用响应曲面法(RSM)分析三个因素对响应值的影响。结果：最佳提取工艺条件为乙醇浓度77.5%，提取温度50℃，提取时间2 h，料液比30:1 (mL/g)时，提取率为92.3%；结论：该丹皮酚提取工艺稳定可靠，能应用于工业化生产。

关键词 :响应曲面法，丹皮酚，优化，提取工艺

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1. 引言

牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)是毛茛科植物，其干燥根皮俗称牡丹皮，别名丹皮、粉丹皮、木芍药、条丹皮等，丹皮是一种传统中药，首载于《神农本草经》：主寒热，中风瘛疭、痉、惊痫邪气，除症坚瘀血留舍肠胃，安五脏，疗痈疮。丹皮酚(Paeonol)又称牡丹酚、芍药醇，系牡丹皮挥发油的主要成分。现代药理学研究表明，丹皮酚具有消炎 [1] 、抗乙型肝炎 [2] 、抗心肌损伤 [3] 、抗氧化 [4] 、抗螨虫 [5] 和降血糖 [6] 等作用。随着对丹皮酚药理研究范围的不断拓展，其提取和分离的工艺研究也在不断深入。

目前丹皮酚的提取方法有CO₂超临界萃取法 [7] 、超声法 [8] 、微波法 [9] 、水蒸气蒸馏法 [10] 和乙醇渗漉法 [11] 等。对于CO₂超临界萃取法、超声法和微波法，工业生产中提取设备费用昂贵；水蒸气蒸馏法容易产生大量工业废水；乙醇渗漉法提取速率慢，提取时间长。因此，采用溶剂提取时，如果能优化工艺，回收溶剂，减少废液排放，在提取工艺简单化同时，使生产成本大大降低，将更加符合实际生产需求。响应曲面法(Response surface methodology, RSM)将有助于对提取工艺进行优化。它是一种集数学、统计学于一体的试验设计方法，通过描绘评价指标(或响应值)对试验变量的响应面，采用多元二次方程来拟合变量和响应值之间的函数关系，最终找到试验变量的最佳组合及最优响应值 [12] [13] 。与往常用的均匀设计和正交设计相比，弥补了实验精度不够，建立的数学模型预测性较差的缺点，在中药有效成分提取中发挥着越来越重要的作用。

本研究拟采用乙醇溶剂法提取丹皮酚，先设计单因素实验，再采用Box-Behnken响应曲面法考察乙醇浓度(体积分数)、提取温度和提取时间三个因素对提取率的影响，从而优化丹皮酚的提取工艺，为实际生产提供参考数据与依据。

2. 材料

2.1. 材料

丹皮购自重庆市垫江县澄溪镇丹皮种植区，将丹皮烘干和粉碎待用。

2.2. 仪器

岛津LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器公司)；UV-3150型紫外可见分光光度计(日本Jasco公司)；AL-104电子分析天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司)；德国Heidolph MR Hei-Tec磁力搅拌器(香港德祥科技有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；FFC-45D型粉碎机(临沂大华机械厂)；DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

2.3. 药品及试剂

丹皮酚(西南大学药学院药用资源化学研究所自制，HPLC纯度 > 99.0%)；甲醇(色谱纯，成都市宜邦科析仪器有限公司)；磷酸，95%乙醇(皆分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；纯水器(重庆前沿水处理设备有限公司)。

3. 方法

3.1. 丹皮酚含量的测定

3.1.1. HPLC条件 [14]

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相甲醇−0.1%磷酸水溶液(45:55, V/V)；流速0.5 mL·min⁻¹；紫外检测波长274 nm；进样量10 μL。

3.1.2. 丹皮酚的提取率

按照2015版《中国药典》，牡丹皮药材含量测定项下操作，平行测3次。丹皮酚提取率(%) = 丹皮酚提取量(g)/药材中丹皮酚总量(g) × 100%。

3.2. 原料预处理

将丹皮在50℃恒温鼓风干燥箱内烘干，粉碎过60目筛后备用。丹皮颗粒大，丹皮酚的提取溶出度小；颗粒小，原料过滤分离慢，颗粒直径控制在1 mm左右。

3.3. 丹皮酚的提取与测定

称取丹皮样品50 g，置于配回流装置的圆底烧瓶中，加入不同浓度(体积分数)的乙醇溶液250 ml，在不同温度下磁力搅拌(1500 rpm)一定的时间，过滤后滤液定容，根据药典中的高效液相色谱法，以纯化的丹皮酚标准品作标准曲线，测定丹皮酚的提取率。实验先采用单因素实验考察料液比、乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚提取率的影响。四组单因素实验具体方案如下：① 料液比10:1、20:1、30:1和40:1 (mL/g) (固定条件：乙醇浓度80%、提取温度50℃、提取时间2 h)；② 乙醇浓度20%、40%、60%、80%和95% (固定条件：料液比20:1 (mL/g)、提取温度50℃、提取时间2 h)；③ 提取温度15℃、30℃、50℃、70℃和90℃ (固定条件：料液比20:1 (mL/g)、乙醇浓度80%、提取时间2 h)；④ 提取时间0.5 h、1 h、2 h、3 h和4 h (固定条件：料液比20:1 (mL/g)、乙醇浓度80%、提取温度50℃)。每组实验重复3次。

3.4. 数据分析方法

根据单因素实验结果，选取乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚提取率影响较大的因素，通过响应曲面法，利用Box-Behnken软件对提取条件进行回归设计和优化，每一变量的低、中、高水平分别为−1，0，1进行编码，实验因素和水平见编码见表1。

4. 结果与分析

4.1. 单因素实验

4.1.1. 料液比对丹皮酚提取率的影响

由图1可知，牡丹中丹皮酚的提取率随着料液比的增加先增大后趋稳定，当料液比大于30:1时，提取率略有降低。这可能与固液两相的扩散和吸附平衡有关，起初以扩散为主，溶质浓度增大，提取率增

表1. Box-Behnken中心组合实验设计方案

图1. 料液比对丹皮酚提取率的影响

加；然后随着溶剂增多，固相吸附能力增加，溶质在溶剂中的分配减少，提取率出现降低。

4.1.2. 乙醇浓度对丹皮酚提取率的影响

从图2得到，随着乙醇浓度的增加，丹皮酚的提取率先增加后降低。乙醇浓度增加，丹皮酚的溶解度增加，当达到80%时，丹皮酚提取率达到最高90%；当继续增加乙醇浓度时，其他脂溶性成分溶解度也开始增加，有可能影响了丹皮酚的提取效果。

4.1.3. 提取温度对丹皮酚提取率的影响

从图3观察发现，随着提取温度的增加，丹皮酚的提取率增加，但当温度70℃~90℃，乙醇的挥发速度加快，溶剂有损失。在低于50℃时，提取率增加明显；当温度高于50℃时，提取率的增加明显减缓。

4.1.4. 提取时间对丹皮酚提取率的影响

从图4观察可知，提取2 h时提取率最高，随着提取时间的延长，提取效果趋于稳定。这可能与溶质在溶剂中的饱和度有关，当溶质逐渐达到最大溶解时，丹皮酚提取率变化减小。

4.2. 丹皮酚提取响应曲面法实验

4.2.1. 丹皮酚提取率拟合回归模型的建立

按照实验设计(表2)，采用design-expert软件进行多元回归拟合：以丹皮酚的提取率(Y)为响应值，各因子与响应值之间的回归方程为：Y = −1.11 + 0.04A + 0.01B + 0.07C + 5.89 × 10⁻⁵AB + 1.09 × 10⁻³AC + 4.3 × 10−⁴BC − 2.61 × 10⁻⁴A² − 1.25 × 10^-4B² − 3.91 × 10⁻²C² (R² = 0.9905)。

表2. 响应面法实验设计与结果

图2. 乙醇浓度对丹皮酚提取率的影响

图3. 提取温度对丹皮酚提取率的影响

图4. 提取时间对丹皮酚提取率的影响

4.2.2. 回归方程显著性分析

从表3可以看出，乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚的提取率分别具有极显著(P < 0.01)。回归模型方程的决定系数R² = 0.9905，变异系数1.46，失拟项不具有显著差异(P > 0.05)，说明实验拟合度高，误差小，实验具有可靠性，能用于乙醇提取丹皮酚工艺的分析优化。

4.2.3. 响应曲面分析

响应面优化与预测：依据二维等高线和三维响应面，当设定Y最大时，丹皮酚最佳提取工艺。此时

表3. 回归方程显著性分析

注：*表明显著性差异(P < 0.05)；**表明极显著性差异(P < 0.01)。

图5. 乙醇浓度、提取温度、提取时间各两因素对丹皮酚提取率的三维响应面曲线

乙醇浓度77.5%，提取温度50℃，提取时间2 h，提取率92.3%。结果见图5。

5. 结论

目前丹皮酚由于具有显著的抗炎活性，在国内医药市场上已得到广泛应用，但是提高和优化丹皮酚的提取纯化工艺，对丹皮酚原料市场具有重要意义。本实验通过单因素和响应曲面实验，研究了丹皮中丹皮酚的提取工艺并进行了优化，得出用77.5%乙醇浓度、50℃提取温度、2 h提取时间和料液比30:1 (mL/g)时，丹皮酚的提取率达到92.3%，该提取工艺稳定可靠，能应用于工业化生产。

文章引用

杨 桐. 基于Box-Behnken设计–响应曲面法优化丹皮酚的提取工艺
Optimization of Extract Process of Paeonol by Response Surface Method Based on Box-Behnken Design[J]. 生物医学, 2018, 08(02): 7-15. https://doi.org/10.12677/HJBM.2018.82002

参考文献