ABSTRACT

Objective: To establish UPLC fingerprint of Tinospora sagittata and T. capillipes which is expected to provide standards for the quality control and identification of the Chinese crude drug. Method: The UPLC method was used. Chromatography conditions were Acquity UPLC^®BEN C₁₈ (2.1 × 100 mm, 1.7 µm) column with gradient mobile phase of acetonitrile and 0.3% phosphate acid. UV detection wavelength was 225 nm, the flow rate was 0.25 ml/min and the column temperature was 25˚C. Result: UPLC fingerprints of 10 samples of Tinospora sagittata and T. capillipes were established. 7 mutual peaks were selected as the fingerprint peaks in the samples. Among the obtained fingerprints, most of the detected peaks were separated effectively. 10 samples had higher similarities. Conclusion: The established UPLC fingerprint has desirable accuracy, repeatability and stability, which can be used as reference for the quality control of Tinospora sagittata and T. capillipes.

Keywords:Tinospora sagittata and T. capillipes, UPLC, Fingerprints, Quality Control

金果榄药材的UPLC指纹图谱研究

李扬华，陈秋虹，梁兰娜，徐慧，蒋艳芳

广西分析测试研究中心，广西 南宁

收稿日期：2016年9月26日；录用日期：2016年10月14日；发布日期：2016年10月19日

摘 要

目的：建立金果榄药材的UPLC指纹图谱，为金果榄药材的质量控制提供依据。方法：采用超高效液相色谱法。色谱条件：色谱柱：Acquity UPLC^®BEN C₁₈ (2.1 × 100 mm，1.7 µm)；流动相A：乙腈；流动相B：0.3%磷酸溶液；流速：0.25 ml/min；检测波长：225 nm；柱温：25℃。结果：建立了10批金果榄药材的指纹图谱。金果榄药材有7个共有峰，多数峰可以达到较好分离，具有较高的相似度。结论：建立的超高效液相指纹图谱有较好的精密度、重复性和稳定性，可作为金果榄质量评价参考。

关键词 :金果榄，UPLC，指纹图谱，质量控制

1. 引言

金果榄为防已科植物青牛胆Tinospora sagittata (Oliv.)Gagnep.或金果榄Tinospora capillipes Gagnep.的干燥块根，有清热解毒、利咽、止痛的功效。经研究金果榄含有丰富的化学成分，含掌叶防己碱，青牛胆苦素、巴马汀、金果榄甙、药根碱等化合物。金果榄在广西分布较多，产量较大，是广西特色药材之一，具有重要的经济价值和民间应用基础，已被《中华人民共和国药典》收录，目前现行的《药典》收录有显微鉴别、理化鉴别、巴马汀含量测定等质量控制标准 [1] ，也有文献报道对金果榄中巴马汀、药根碱的HPLC测定方法的研究 [2] ，但对于金果榄的指纹图谱研究未见文献报道。本实验采用超高效液相色谱法，建立金果榄药材的UPLC指纹图谱，为金果榄药材的质量控制提供依据。

2. 实验部分

2.1. 仪器、试剂与材料

超高效色谱仪；Empower 2色谱工作站，检测器:二极管阵列紫外检测器(美国WATERS Acquity)；

电子天平(瑞士梅特勒)；

恒温水浴锅(金坛市易晨仪器制造厂)；

盐酸巴马汀标准对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110732-200506)；

乙腈(色谱纯，德国Merck)；

甲醇(分析纯，广东光华科技股份有限公司)；

超纯水(实验室自制)；

金果榄药材：购于广西各地医药市场，经广西药用植物园 董青松 教授鉴定为防已科植物青牛胆Tinospora sagittata (Oliv.) Gagnep或金果榄Tinospora capillipes Gagnep的干燥块根。产地详见表1。

2.2. 实验方法

1) 色谱条件：色谱柱：Acquity UPLC^®BEN C₁₈ (2.1 × 100 mm，1.7 µm)；流动相：流动相A：乙腈；流动相B：0.3%磷酸溶液，梯度洗脱程序见表2；流速：0.25 ml/min；检测波长：225 nm；柱温： 25 ℃ ；进样量：5 µL。

2) 对照品溶液的制备：精密称取盐酸巴马汀标准对照品1.00 mg，用甲醇溶解，定容于25 ml量瓶中，制得浓度为0.04 mg∙mL⁻¹的标准储备液，备用。

表1. 金果榄药材来源

表2. 流动性梯度洗脱表

3) 供试品溶液的制备

样品溶液制备：取药材粉末(60目)约1 g，精密称定，置圆底烧瓶，加入甲醇50 ml，精密称定重量 加热回流2小时，取出，放冷，补足重量 滤过，过0.2 µm微孔滤膜，即得。

4) 精密度考察：精密吸取供试品溶液5 µL，连续进样6次，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度计算，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度均大于0.950，表明该仪器的精密度良好。

5) 稳定性考察：取同一份供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、18、24、48、72小时等9个时间点进行检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于0.950，供试品溶液的成分在72小时内是稳定的。

6) 重复性：取同一批号金果榄药材粉末6份，按照供试品溶液的制备方法制备，依法检测，6份供试品溶液测得的色谱指纹图谱的全貌直观观察无明显变化，用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于0.950，该方法的重复性较好。

2.3. 结果

1) 指纹图谱的测定

10批金果榄药材按上述实验方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下，分别进样并记录22分钟色谱图(1号金果榄药材的色谱图见图1，盐酸巴马汀标准图谱见图2)。

图1. 金果榄药材的UPLC色谱图

图2. 盐酸巴马汀UPLC标准图谱

2) 共有峰的确定

22分钟内共有8个主要特征峰。通过与对照品图谱比对，其中保留时间为10.6分钟的4号峰为盐酸巴马汀，由于4号峰含量高、分离度较好且比较稳定，故将其作为参比峰，计算其它各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3。10批金果榄药材色谱图中非共有峰面积占总峰面积的百分比小于6％，符合指纹图谱技术要求。

3) 相似度评价

测定10批金果榄药材的供试品，得到不同批次样品的色谱图，采用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A 版”进行相似度评价，10批金果榄药材指纹图谱匹配后的图谱见图3，金果榄药材供试品的相似度在0.947~0.999之间(见表4)表明此10批金果榄药材提取后的指纹图谱相似度良好。

3. 讨论部分

1) 提取条件的选择

分别用甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇等四种提取溶剂对供试品进行超声波和加热回流提取，经比较，加热回流提取对同一组分含量提取率高于超声波提取，当提取溶剂为甲醇时，采用热回流提取提取2小时，色谱图显示色谱峰数较多且色谱峰较高，以其中主要成分盐酸巴马汀提取溶剂含量测定结果显示，提取溶剂最佳为甲醇(见表5)。因此提取条件选择甲醇为提取溶剂，加热回流2小时。

表3. 金果榄药材UPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积和相对保留时间

表4. 10批金果榄药材的相似度结果

表5. 不同提取溶剂盐酸巴马汀含量测定结果

图3. 金果榄药材指纹图谱。S1 - S10：样品1~样品10指纹图谱，R：对照指纹图谱

2) 色谱条件的选择

a) 色谱柱的选择：比较了Acquity UPLC^®BEN C₁₈、Beh shield RP₁₈、Phenyl三种不同的UPLC色谱柱。BEN C₁₈色谱柱效果最佳，通过分析速度与分离效果比较，从2.1 × 50 mm、2.1 × 100 mm和3.0 × 100 mm三种型号中最终选择2.1 × 100 mm型号BEN C₁₈色谱柱。该色谱柱对于组分2与组分3的分离度 ≥ 1，其余色谱柱在这2个组分的分离度在0.7~0.9。

b) 检测波长的选择：采用二极管阵列检测器，对供试品检测波长进行了考察，结果表明在225 nm处各色谱峰均有较好的紫外吸收，色谱信息最为丰富，因此选择该波长作为检测波长。

c) 流动相的选择：选用乙腈0.3%磷酸溶液作为流动相。较之其他的溶液系统磷酸盐–乙腈，乙腈–十二烷基硫酸钠溶液 [3] 、乙腈–醋酸溶液，达到更好的分离效果，且能明显改善色谱峰脱尾现象。采用梯度洗脱对金果榄药材提取液进行分离，最后确定以流动性梯度洗脱表中的流动相进行洗脱，在该条件下，色谱峰的分离效果好，峰形也较好，故确定采用该流动相进行色谱分离。

d) 相似度评价：结果显示10批金果榄药材供试品的相似度在0.947~0.999之间，分析其差异原因主要是本试验所用的药材为不同产地的金果榄，有些为野生品，有些为栽培品，由于气候、土壤等因素，在化学成分等方面存在一定的差异。

金果榄系民间中药，也是苗族、侗族、瑶族等少数民族的习用药物，同名异物或同物异名现象较为严重，容易产生混淆，对用药及生产种植不利。本实验建立了金果榄药材的HPLC指纹图谱的测定方法，实验方法简便，重复性好，得到了金果榄药材UPLC指纹图谱及相关数据，可为金果榄药材及其它含金果榄药材的中药复方制剂制定质量标准提供参考。

文章引用

李扬华,陈秋虹,梁兰娜,徐 慧,蒋艳芳. 金果榄药材的UPLC指纹图谱研究
Study on UPLC Fingerprint of Tinospora sagittata and T. capillipes[J]. 分析化学进展, 2016, 06(04): 79-85. http://dx.doi.org/10.12677/AAC.2016.64012

参考文献 (References)