ABSTRACT

The intramolecular and intermolecular hydrogen bond interaction of chitin makes chitin form a highly crystalline ordered structure of microfibrils, which makes chitin itself difficult to dissolve and difficult to deacetylate. In this paper, the NaOH/urea mixed solution was used to dissolve chitin at low temperature, and then it was precipitated to change its condensed structure, and then deacetylation reaction was carried out. The effects of NaOH/urea weight ratio on the solubility of chitin and NaOH concentration on deacetylation were studied. The structural properties of chitin after dissolution-precipitation treatment were analyzed by FTIR, SEM, XRD and TG. The results show that the NaOH/urea = 12/6(w/w) mixed solution has the best dissolution effect and the solubility is 90%. The original microfibrous ordered structure of chitin after dissolution-precipitation treatment is destroyed, and it has an amorphous state and the accessibility of acetylamine group becomes large. When the NaOH concentration is lowered to 50 wt%, the same degree of deacetylation with 60 wt% of the chitin raw powder is obtained.

Keywords:Chitin, Deacetylation, Dissolution in Low Temperature, High Accessibility

可及度对甲壳素脱乙酰效率的影响初探

卓猛¹，张明勇²，陈凯²，李敬¹，孙宾^1*

¹东华大学，材料科学与工程学院，上海

²海斯摩尔生物科技有限公司，山东 泰安

收稿日期：2019年2月3日；录用日期：2019年2月26日；发布日期：2019年3月4日

摘 要

甲壳素的分子内与分子间氢键相互作用使甲壳素形成微纤维网状的高度结晶有序结构，导致甲壳素本身难脱乙酰。本文以NaOH/尿素混合溶液作为溶剂低温下溶解甲壳素，再将其沉淀，改变其凝聚态结构，然后进行脱乙酰反应。研究了NaOH/urea配比对甲壳素溶解度及NaOH浓度对脱乙酰反应的影响，采用FTIR、SEM、XRD、TG表征分析了溶解–沉淀过程处理后甲壳素的结构性能。结果表明，NaOH/urea = 12/6(w/w)混合溶液的溶解效果最佳，溶解度可达90%。溶解–沉淀处理后的甲壳素原有的微纤维状有序结构被破坏，呈无定形态且乙酰胺基可及度变大。NaOH浓度降低至50 wt%时即会起到用60 wt%处理甲壳素原粉同样的脱乙酰度，制得壳聚糖。

关键词 :甲壳素，脱乙酰，低温溶解，高可及度

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1. 引言

甲壳素主要从废弃蟹、虾和龙虾壳等海产品废弃物中提取，来源广泛且可再生，是最丰富的天然多糖，也是最重要的化学原料之一 [1] 。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物。甲壳素及壳聚糖可以方便地加工成不同的材料，如膜 [2] 、凝胶 [3] [4] 、微球 [5] 和纳米纤维 [6] 。这些材料可用于生物医学领域，包括药物递送、组织工程和伤口愈合等 [7] 。

天然甲壳素结构是由排列有序的结晶区和排列无序的无定形区交错排列而成，也就是说甲壳素结晶区在三维空间上是规则的、伸直的、紧密的有序排列，无定形区则是由疏松的分子链无规则卷曲和相互缠结而成的 [8] 。甲壳素的分子内与分子间氢键相互作用使甲壳素形成微纤维网状的高度结晶有序结构，这导致甲壳素难以脱乙酰制备壳聚糖。壳聚糖经由甲壳素在浓NaOH溶液、高温下脱除乙酰基制得。但是，由于甲壳素的半结晶结构，乙酰胺基可及度较小，即OH-不易接触到乙酰胺基，使得脱乙酰反应效率低、脱乙酰不完全。

迄今为止，只有少量的溶剂可以溶解甲壳素 [9] ，例如LiCl/DMAc、CaCl₂/CH₃OH、离子液体、六氟异丙醇，碱/尿素。碱/尿素是一种近年来开发的新型绿色溶剂。其溶解机理为：在低温下，溶剂中的NaOH和urea小分子先组装成水合物，水合物破坏了甲壳素大分子链间原有的分子间作用力，与之形成新的氢键。最后，氢氧化钠/尿素水合物包覆在甲壳素分子链上形成管状包合物而导致甲壳素溶解在溶剂中 [10] [11] 。

本文为了增大乙酰胺基可及度，使OH-能够充分接触乙酰胺基，使其易于脱乙酰高效地制备高脱乙酰壳聚糖。选用NaOH/urea混合溶液低温下溶解甲壳素，再将甲壳素析出，通过溶解–沉淀的方法改变甲壳素凝聚态结构，使原有致密的结构变得松散。然后进行脱乙酰反应，探究溶解–沉淀后甲壳素对脱乙酰反应的促进作用。

2. 实验材料与方法

2.1. 材料与试剂

甲壳素，高密度，浙江金壳药业有限公司；NaOH，分析纯，国药；尿素，分析纯，国药。

2.2. 实验设备

超低温冰箱：DW-60W108，浙江捷盛制冷科技有限公司；油浴锅：DF-101S，湖南力辰仪器科技有限公司；环境扫描电镜：S-4800，HITACHI；红外光谱仪：Nicolet6700，美国赛默飞世尔科技；X射线衍射仪：D8，Bruke。

2.3. 实验方法

2.3.1. NaOH/urea混合溶液溶解甲壳素

配置一系列不同质量比例8:4:88、10:5:85、12:6:82、14:7:79、16:8:76的NaOH/urea/water溶液，置于超低温冰箱−40℃预冻至冰状。称取得到的冰状碱溶液97 g，加入3 g甲壳素粉末，室温下搅拌至大部分溶解，待其温度升到室温后，再放入冰箱−40℃冷冻，重复2~3次冻融循环。

2.3.2. 高可及度甲壳素的制备

室温下，7000转/min离心6 min，去除未溶解的甲壳素，制得甲壳素低温冻融液。将甲壳素冻融液逐步加入到400 mL去离子水中，500 rpm磁力搅拌10 min后，用砂芯漏斗过滤析出的甲壳素。

2.3.3. 甲壳素粉末的脱乙酰反应

分别称取3 g甲壳素粉末和溶解–沉淀后的甲壳素，量取150 mL 40~60 wt%的NaOH溶液，80℃下反应6 h，过滤出产物水洗至中性，干燥后保存。甲壳素脱乙酰反应方程如图1所示。

图1. 甲壳素脱乙酰反应方程式 [12]

2.4. 溶解度测试

溶解过程中得到的未完全溶解的甲壳素碎片放入真空干燥箱，在40℃下干燥，称重记为W。

$\text{Solubility}=\frac{3-\text{W}}{3}\times 100\%$

2.5. 脱乙酰度测试

将脱乙酰后粉末，置于真空干燥箱中60℃干燥。采用红外KBr压片法测试，设置扫描范围4000~400 cm⁻¹，扫描次数32次，频率4 cm⁻¹。DD为脱乙酰度，A₁₅₆₀/A₂₈₇₅是1560和2875 cm⁻¹吸收峰强度比例 [11] 。

$\frac{A_{1560}}{A_{2875}}=0.0125\times \left(1-DD\right)+0.2$

2.6. XRD分析

将脱乙酰后粉末，置于真空干燥箱中60℃干燥。采用粉末X射线衍射仪测试纤维的结晶性能。测试条件：铜靶，管压40 kV，管流200 mA，扫描范围5˚~60˚。

3. 结果与讨论

3.1. NaOH/Urea溶解甲壳素的影响因素

图2为甲壳素粉末溶解于−40℃预冻碱液的实物照片，将甲壳素粉末和预冻后的冰状碱液混合后，不断搅拌，甲壳素会逐渐溶解。再次冷冻–溶解操作过程中，液态水结冰则体积增大，水结成冰的作用力能够进一步削弱、打断甲壳素分子间氢键，破坏其结晶结构，因此，更多的碱溶液分子能够渗透入甲壳素的分子链段中，进而逐渐破坏其整体结构，促进甲壳素的溶解。NaOH/urea质量配比对甲壳素溶解度的影响如图3所示，NaOH/urea = 12/6(w/w)溶解效果最好，溶解度可达90%，见图2。溶解度先增大后减小，因为随着NaOH、urea溶质比例的增加，混合溶液冰点越低，没有来自于水结冰的作用力进一步削弱、打断甲壳素分子间氢键，破坏其结晶结构，导致溶解甲壳素能力变小。

图2. 甲壳素粉末低温溶解过程实物照片

图3. NaOH和Urea质量比例对甲壳素溶解的影响

为了探究NaOH/urea低温溶解过程对甲壳素结构的影响，利用红外光谱分析甲壳素冻融前后的基团变化。如图4所示，未处理甲壳粉末的FTIR谱图中，3445 cm⁻¹处的宽带对应于甲壳素-OH振动及氢键作用、1660 cm⁻¹处为C=O的酰胺I谱带、在1623 cm⁻¹处归属于C-N振动与C=O基团的拉伸的叠加、1560 cm⁻¹处的强峰是酰胺II谱带、1310 cm⁻¹处为C-N振动。在甲壳素冻融液(NaOH/Urea = 12/6)红外谱图中，1560 cm⁻¹处酰胺II谱带和1310 cm⁻¹处峰消失，因为低温下，NaOH和Urea混合溶液组装形成水合物，水合物再和甲壳素分子链上乙酰胺基(-NHCOCH₃)、羟基(-OH)基团相互作用，破坏原有的分子间氢键作用，与之形成新的氢键，从而包裹在甲壳素分子链周围，形成管状包合状物，使甲壳素溶解在混合碱/尿素溶液中 [10] [11] 。

图4. 甲壳素粉末和甲壳素冻融液(NaOH/Urea = 12/6) FTIR谱图

3.2. 高可及度甲壳素结构分析

图5(a)和图5(c)分别为甲壳素粉末和溶解–沉淀后甲壳素实物照片。由图5(b) (放大倍数2k及10k)可见，甲壳素粉末为致密有序的微纤状结构，一束束粗纤维束同向排列，粗纤维束又由很多条微纤维组成，中间孔洞为脱钙后留下的空穴。正是由于这种有序的结晶结构导致甲壳素本身难溶解及难脱乙酰。溶解–沉淀后的甲壳素失去了微纤维结构，变成细小的颗粒状结构，图5(d) (放大倍数10k)。因为沉淀过程中，大量的水导致甲壳素与NaOH/urea溶液形成的复合物被破坏，使得裸露的甲壳素分子链自缔合聚集，图中没有发现致密的微纤维状结构，这表明溶解–沉淀后的甲壳素乙酰胺基的可及度变大。

图5. 甲壳素粉末溶解–沉淀后的实物照片及SEM图

XRD衍射谱图也可佐证说明溶剂-沉淀后甲壳素乙酰胺基可及度变大。由图6可知，溶解-沉淀后甲壳素(020)、(120)、(110)、(130)、(013)晶面所对应特征衍射峰强度锐减，几乎消失。(020)晶面是a方向上甲壳素链的紧密排列，(110)晶面是b方向上的紧密堆积。这表明经溶解–沉淀过程后甲壳素原有的结晶结构被破坏，致密整齐的分子排列变得杂乱，变成无定形结构，乙酰胺基可及度变大。

图6. 甲壳素粉末和溶解–沉淀后甲壳素XRD谱图

TG分析同样表明溶解–沉淀后甲壳素结构变得松散，可及度变高。由图7可知，未经处理的高度有序甲壳素具有良好的热稳定性，其起始分解温度在342.1℃，最大热分解速率−19.74%/min，最大热分解温度395.2℃，溶解–沉淀后甲壳素起始分解温度321.6℃，最大热分解速率−13.72%/min，最大热分解温度360.3℃。这表明溶解–沉淀后的甲壳素热稳定性有所下降，因为其结晶结构被破坏，结构变得松散不致密。

图7. 甲壳素粉末和溶解-沉淀后甲壳素XRD谱图

3.3. 脱乙酰度分析

甲壳素和壳聚糖的根本区别在于乙酰度(DA: Degree of Acetylation)或脱乙酰度(DD: Degree of Deacetylation)的不同。当DA < 45%或DD > 55%，即为壳聚糖。

图8. 碱浓度与脱乙酰度的关系

甲壳素的脱乙酰反应实际上是酰胺键在碱性条件下的水解反应。作为催化剂，NaOH在甲壳素乙酰化过程中起催化作用 [13] 。本文将未处理的甲壳素和经溶解–沉淀处理后的甲壳素在80℃下反应6 h，比较不同NaOH浓度对脱乙酰的影响，见图8。随着NaOH浓度从40 wt%增加到60 wt%，未处理的甲壳素脱乙酰度由34.5%逐渐增加至58.2%。NaOH浓度要达到60 wt%，才能使未处理的甲壳素有效的脱乙酰，制得壳聚糖。而经过溶解–沉淀后，NaOH浓度为50 wt%时就有脱乙酰效果，脱乙酰度为57.3%，而60 wt% NaOH处理后，其脱乙酰度可达67.4%。溶解–沉淀后的甲壳素，凝聚态结构变得松散，晶区被破坏，乙酰胺基的可及度变大，更容易受到OH⁻的进攻，因此制得的壳聚糖脱乙酰度更高。

4. 结论

甲壳素的脱乙酰化反应受天然甲壳素紧密有序的微纤维状结构及空间位阻影响很大。经溶解–沉淀后的甲壳素，晶区被破坏，微纤维状结构也被破坏，凝聚态结构变得松散，乙酰胺基的可及度变大。脱乙酰反应中，未处理的甲壳素要在碱浓度达60 wt%时才能制得壳聚糖，而经溶解–沉淀处理后，在更低的碱浓度50 wt%即可达相近的脱乙酰度，表明溶解–沉淀后的甲壳素乙酰胺基的可及度变大，促进脱乙酰反应的进行，提高了脱乙酰效率。溶解–沉淀工艺制备的壳聚糖预期会有着更窄的分子量分布，将在后续研究。

文章引用

卓 猛,张明勇,陈 凯,李 敬,孙 宾. 可及度对甲壳素脱乙酰效率的影响初探
Preliminary Study on the Effect of Accessibility on the Deacetylation Efficiency of Chitin[J]. 生物过程, 2019, 09(01): 1-8. https://doi.org/10.12677/BP.2019.91001

参考文献