ABSTRACT

The aim was to study the influence of different tillage methods on functional diversity of soil microbial community in the North China farming areas. Using the method of Biolog-Eco, a comparative study was made on the utilization level of single carbon source by the soil microbes of four tillage methods (abandoned LF, conventional FT, rotary RT, no-tillage NT). The results showed that: 1) the Average Well Color Development (AWCD) value of abandoned tillage, no-tillage, rotary tillage were significantly higher than conventional tillage (P < 0.05); 2) the Shannon index (H) and Simpson’s Dominance (D) of the soil microbial community of abandoned tillage, no-tillage, rotary tillage were significantly higher than conventional tillage (P < 0.05), whereas the Shannon index (H), Simpson’s Dominance and Substrate evenness (E) had no significant difference among abandoned tillage, no-tillage and rotary tillage (P > 0.05); 3) principal component analysis indicated that the carbon source utilization of soil microbial community was similar among the rotary tillage and no-tillage treatment. In conclusion, rotary tillage with straw return and abandoned tillage were helpful to improve the soil metabolic activity of microorganism and the functional diversity of soil microbial communities.

Keywords:Tillage Methods, Soil Microbial Community, Biolog, Functional Diversity

不同耕作方式对农田土壤微生物功能多样性的影响

刘红梅^1,2，张贵龙^1,2，皇甫超河^1,2，杨殿林^1,2，赵建宁^1,2

¹农业部环境保护科研监测所，天津

²天津市农田生态与环境修复技术工程中心，天津

收稿日期：2016年1月30日；录用日期：2016年2月19日；发布日期：2016年2月23日

摘 要

为揭示耕作方式对华北农田土壤微生物群落功能多样性的影响，采用Biolog-Eco技术，研究了4种耕作处理(撂荒LF、翻耕FT、旋耕RT、免耕NT)土壤微生物群落功能多样性的变化。结果表明：1) 不同耕作方式下土壤微生物群落平均颜色变化率(Average well color development) AWCD值从高到低依次为LF > NT > RT > FT，LF、NT、RT的AWCD显著高于FT (P < 0.05)。2) LF、NT和RT处理土壤微生物群落丰富度指数H、优势度指数D均显著高于FT处理(P < 0.05)。LF、NT和RT的丰富度指数H、优势度指数D和均匀度指数E在观测期无显著差异(P > 0.05)。3) 主成分分析表明，RT与LF土壤微生物群落碳源利用类型相似。旋耕秸秆还田和撂荒有利于提高土壤微生物活性和土壤微生物群落功能多样性。

关键词 :耕作方式，土壤微生物，Biolog，功能多样性

1. 引言

土壤微生物是陆地生态系统的重要组成部分，是土壤有机质及养分转化、循环的主要动力，在推动地球生物化学元素循环过程中起着重要作用。土壤微生物组成的质与量的变化是土壤健康状况的重要敏感指示[1] -[3] 。土壤微生物多样性可以定义为生命的丰富度，代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制及土壤胁迫对微生物群落的影响，因此对土壤微生物群落结构和功能的研究一直是土壤与植物营养学的研究热点 [4] [5] 。土壤的细微变化会引起土壤微生物多样性的变化，并与土壤的生态稳定性密切相关。

耕作能改变土壤物理、化学、生物属性，进而影响土壤微生物的结构及其多样性。目前关于耕作对微生物群落结构和多样性方面研究较多，但并未形成一致结论。一些研究结果表明，在免耕系统中，土壤微生物的活性和数量都显著高于翻耕土壤，表层土壤的微生物土壤质量参数与耕作频度反相关 [6] - [8] 。减少土壤耕作结合秸秆覆盖可提高表层土壤细菌总量，增加土壤微生物的多样性 [9] - [12] 。Drijber等(2000)利用PlFA方法研究小麦地在长期免耕条件下微生物群落结构变化时发现，免耕能使土壤碳量和微生物量倾向于地表分布 [13] 。而另一些研究显示，单独的耕作措施对土壤微生物的影响很小 [14] 。Diosma等(2003)研究了耕作对阿根廷萨拉多河典型的粘化湿软土土壤微生物区系的影响，发现在少耕情况下，尽管土壤有机残余物量显高于传统耕作，但土壤微生物区系结构和活性没有发生改变 [15] 。但Meriles等(2009)发现，免耕情况下土壤中真菌和放线菌没有显著性变化 [16] 。为此，本试验采用Biolog微平板法对不同耕作处理方式下土壤微生物群落功能多样性进行比较分析，探讨耕作方式对土壤微生物的影响，以期为采取选择适宜的耕作方式和维持农田可持续利用提供科学依据。

2. 材料与方法

2.1. 试验区概况

试验于2008年6月开始设置，在中国农业科学院武清农业生态环境野外科学观测试验站内进行，该试验站位于天津市武清区(北纬39˚21'，东经117˚12')，海拔6.3 m，属于暖温带半湿润大陆性气候。年平均气温在11.4℃~12.9℃，7月气温最高，平均在26℃~27℃以上，1月气温最低，平均在3℃~5℃，年平均无霜期为196~246 d，年均降水量520~660 mm。该地区土壤类型和初期养分指标在作者已发表的文献中有详细描述，具体见参考文献 [17] 。

2.2. 试验设计

轮作方式为冬小麦–夏玉米，连续处理6年。试验采用随机区组设计，设撂荒(LF)、翻耕(FT)、免耕(NT)、旋耕(RT) 4个处理，撂荒不耕不种，翻耕耕深 25 cm ，旋耕耕深 10 cm ，免耕不耕。玉米秸秆还田量为4000 kg/hm²，施氮量为180 kg/hm²；小麦秸秆全量还田，施氮量为150 kg/hm²；秸秆粉碎长度为8~10 cm。小区面积为 400 m ² ( 40 m × 10 m )，所有处理三次重复，小区间由 50 cm 走道间隔。田间管理同一般大田生产。

2.3. 样品采集及预处理

在2008年玉米播种前进行土壤本底样品采集，在2014年玉米收获后采集土壤样品。在各个处理小区按“S”型取样法选取6点，用土钻法取0~ 20 cm 土层土样，混合均匀带回实验室，去除植物根系和砾石，采取四分法，将不少于1 kg土壤装入无菌封口袋，放入冰盒冷藏，运至实验室。将土壤样品分成两部分：一部分放入−20℃冰箱保存，供微生物实验用；另一部分在室内风干，将风干土过 0.25 mm 和 1.00 mm 筛，用于测定土壤基本理化性质。

2.4. 研究方法

土壤有机质含量采用重铬酸钾–氧化外加热法；全氮采用半微量凯氏法；全磷采用钼锑抗比色法；硝态氮采用紫外分光光度法；铵态氮采用靛酚蓝比色法；速效磷采用钼锑抗比色法，具体见参考文献 [18] 。

Biolog试验：先测定土壤含水量，称取相当于10 g烘干土壤的新鲜土壤样品于已灭菌的三角瓶中，在超净工作台中在三角瓶中加入90 ml灭菌NaCl溶液(0.85%)，用封口膜将瓶口封好放入振荡器，设置转速为250 r/min，震荡30 min。取出后，在超净工作台中静置10 min，吸取上清液5 ml于新三角瓶中，用0.85%的无菌NaCl溶液将土样稀释至10⁻²，重复稀释至10⁻³。将稀释液倒入已灭菌的点样槽内，将上述稀释液加入到Biolog-Eco微平板孔中，每孔加样量150 μl。将接种好的Biolog-Eco微平板置于培养箱中，于28℃恒温条件下培养，每隔24 h在Biolog微孔板读数仪(BIOLOG Inc., USA)上读数，共进行7 d。

2.5. 数据分析

微生物整体活性指标采用微平板每孔颜色平均变化率(Average well color development,)来表示，单孔平均颜色变化率()计算方法如下：

式中：为每个有培养基的孔在590 nm下光密度值，R为每个有培养基的孔在750 nm下的光密度值，为Biolog-Eco微平板上供试碳源的种类数，n值为31。

采用Biolog-Eco平板孔中培养96 h的数据计算土壤微生物群落功能多样性指数，计算公式如下：

Shannon-Wiener物种丰富度指数H：

Simpson优势度指数D：，

Shannon-Wiener均匀度指数E：

式中Pi为第i孔相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比值。H是Shannon指数，S是有颜色变化的孔的数目。

试验结果采用SPSS 16.0软件进行分析，单因素方差分析(one-way ANOVA)检验各项特征指标的差异，用Duncan新复极差法分析其差异显著性(α = 0.05)。

3. 结果与分析

3.1. 不同耕作方式下土壤微生物的平均颜色变化率(AWCD)

不同耕作方式下土壤微生物利用碳源能力和代谢活性用AWCD值表示。培养开始后，每隔24 h测定各处理的AWCD值，共培养168 h，得到AWCD随时间的动态变化图见图1。培养24 h之前AWCD值均很小，几乎为零，24 h之后随着培养时间的延长AWCD值快速增长，说明在24 h之后碳源被迅速利用。随着培养时间的延长，4种不同耕作方式土壤中微生物群落的AWCD值均呈增长趋势，其中，LF处理土壤微生物群落AWCD值升高最快，NT与RT处理土壤微生物群落AWCD值趋势相近，FT处理AWCD值升高最慢。不同利用方式下土壤微生物群落利用单一碳源能力的顺序为LF > NT > RT > FT。在培养的168 h之内，LF、NT、RT土壤微生物对总体碳源利用率平均值分别比FT高67.73%、45.88%、36.24%。说明FT处理土壤微生物群落代谢慢，活性弱，LF处理土壤微生物群落代谢最快，活性最强。

3.2. 不同耕作方式下土壤微生物群落功能多样性指数

华北典型农田不同耕作方式下，土壤微生物群落物种丰富度指数H、均匀度指数E和优势度指数D如表1所示。不同耕作处理方式下，土壤微生物群落功能多样性指数不同，表明土壤微生物功能多样性发生了变化。LF处理的物种丰富度指数H、和优势度指数D均最高，NT次之，FT最低，RT处理均匀度E指数最高。方差分析结果表明，4种不同耕作方式下土壤微生物群落丰富度指数和优势度指数差异显著，均匀度指数无显著差异。LF、RT与NT处理的土壤微生物群落丰富度指数均显著高于FT处理；LF、NT与RT3种耕作处理的土壤微生物群落丰富度指数H、均匀度指数E和优势度指数D均无显著差异。

3.3. 主成分分析

3.3.1. 不同碳源在主成分上的载荷值

根据官能团将Biolog-Eco板上的碳源分为4大类：糖类及其衍生物12种、氨基酸及其衍生物6种、脂肪酸和脂类5种、代谢中产物和次生代谢物8种。Biolog-ECO板上31种碳源在前2个主成分上的载荷值见表2，以主成分PC1的载荷值降序排列。载荷值越高，表示该种碳源对主成分的影响越大。由表2可见，与第1主成分PC1具有较高相关性的碳源有11种，其中糖类2种，氨基酸类4种，脂类2种，代谢中产物及次生代谢物3种，表明影响第1主成分的碳源主要是氨基酸类和代谢中间产物及次生代谢物。与第2主成分PC2具有较高相关性的碳源有9种，其中糖类4种，氨基酸类1种，脂类2种，代谢中产物和次生代谢物2种，表明影响第2主成分的碳源主要是糖类。表明在不同耕作处理条件下华北农田土壤微生物利用的主要碳源是糖类、氨基酸类和代谢中间产物及次生代谢物。

3.3.2. 不同处理主成分分析

主成分个数的提取原则是相对应特征值大于1的前m个主成分，一般要求累计方差贡献率达到85%以上。根据此原则，共提取了7个主成分，累计贡献率达到94.78%。其中第1主成分PC1的贡献率为39.56%，权重最大；第2主成分PC2的贡献率为24.12%，第3-7主成分的贡献率分别为：12.33%、6.85%、4.92%、3.55%和3.45%。因第3-7主成分贡献率较小，选取前两个主成分进行分析。以PC1为横轴，PC2为纵轴，以不同处理在两个主成分上的得分值为坐标作图，得到不同处理土壤微生物碳源利用的主成分分析图(图2)。

图1. 不同耕作处理土壤微生物群落AWCD随时间的动态变化

图2. 不同处理土壤微生物碳源利用主成分分析

表1. 不同耕作方式下土壤微生物群落功能多样性指数

注：同一列中不同字母表示差异达到显著水平(P < 0.05)

表2. 31种碳源的主成分载荷因子

主成分分析解释了不同处理土壤微生物碳源利用是否存在差异。样本在主成分轴上分布和微生物对碳源底物的利用能力相关。由图2可见，不同处理在PC轴上出现了明显的分布差异。不同耕作方式的土壤微生物群落的碳利用模式分成了3类。RT与LF分布在PC1轴正方向和PC2轴的负方向上；NT分在PC2轴正方向和PC1的负方向上，FT分布在PC1和PC2的负方向上。分析表明RT与LF土壤微生物群落碳源利用类型相似。

4. 讨论

Biolog技术，是以微孔板碳源利用为基础的定量分析方法，基于微生物群落对碳源利用度来描述微生物功能的动态变化 [19] [20] ，已广泛应用于评价土壤微生物群落的功能多样性。土壤微生物群落平均颜色变化率(AWCD)值越高，表明土壤微生物利用碳源能力和代谢活性也就越高。本研究结果得出不同耕作处理的土微生物AWCD值不同，表明对碳源利用能力和代谢活性不同。土壤微生物AWCD值顺序为撂荒 > 免耕 > 旋耕 > 翻耕。翻耕处理的土壤微生物AWCD值最小，撂荒处理土壤AWCD值最高。这与时鹏等 [21] 和Zabinski等 [22] 研究结果一致。可能是因为耕作增加了对土壤的搅动，破坏土壤结构，不利于维持土壤团聚体结构，未受干扰和干扰较少的土壤微生物的碳源活性高于受干扰较多的土壤。传统耕作破坏了土壤土壤团聚体结构，加速了有机物的损失，土壤微生物活性降低。

对土壤微生物多样性指数分析表明，不同耕作方式下土壤微生物群落的功能多样性指数不同。翻耕处理物种丰富度指数和优势度指数最低，撂荒处理均最高；撂荒、旋耕秸秆还田和免耕秸秆还田处理3种不同耕作方式下土壤微生物群落功能多样性指数无显著差异。董立国等 [10] 研究表明，免耕秸秆覆盖土壤微生物丰富度指数和多样性指数显著高于常规耕作。这与本试验研究结果一致。姬艳艳等 [23] 研究表明，撂荒和免耕处理土壤微生物多样性指数显著高于翻耕和旋耕处理。与本试验研究不一致。这可能是本试验进行了秸秆还田，秸秆还田可为土壤微生物提供充足的有效养分，有利于提高土壤微生物多样性和活性 [11] [24] [25] 。

主成分分析表明，华北农田在不同耕作方式下对第1和第2主成分相关碳源利用模式和利用能力不同。不同耕作处理土壤微生物碳源利用能力存在显著差异，土壤微生物群落代谢特征也不同，说明耕作方式对土壤微生物产生了较大影响。第1主成分解释了大部分变异，撂荒与旋耕秸秆还田分布在PC1轴的正方向上，免耕和翻耕秸秆还田分布在PC1轴的负方向上。这与时鹏等 [21] 和吕春莎等 [24] 研究结果一致。姬艳艳等 [23] 研究表明，撂荒和免耕处理下土壤微生物利用碳源类型具有相似性。萨如拉等 [26] 研究表明，玉米秸秆深翻还田可以提高显著提高土壤有益微生物活性，这与本试验研究结果不一致。本研究表明撂荒和旋耕秸秆还田处理下土壤微生物功能多样性具有相似活性。

为了促进农业的可持续发展，应采取合理的耕作措施，保护土壤微生物。目前，关于耕作和秸秆还田对微生物群落结构和多样性影响较为一致的结论是免耕，少耕和秸秆还田能改善微生物群落结构，有利于维持土壤微生物多样性 [9] [10] [27] 。Bending等 [25] 研究了作物残茬、土壤有机质质量和土壤微生物多样性之间的相互作用，秸秆或根茬还田都能够提高土壤微生物的多样性。Adl等 [28] 研究发现长期免耕可以增加棉田土壤微生物多样性。董立国等 [10] 和李景等 [9] 研究发现免耕秸秆覆盖促进了土壤微生物活性，增加了土壤微生物数量。在本研究介绍的不同耕作方式中，撂荒、免耕秸秆还田与旋耕秸秆还田比翻耕秸秆还田有利于维持土壤微生物的多样性及活性。这与大多数研究结果一致。

本研究利用Biolog微平板法只初步阐明了不同耕作方式与秸秆还田对土壤微生物群落功能多样性的影响，对其具体影响机制尚不明确。因此要综合评价耕作方式对土壤微生物的影响，需结合磷脂脂肪酸(PLFA)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)等方法，进一步研究耕作与秸秆还田对土壤微生物群落的影响，并通过分析微生物群落与土壤有机碳库的关系，探讨微生物群落变化的原因。

5. 结论

本研究通过对4种耕作处理土壤微生物碳源利用能力以及功能多样性分析，初步得出以下结论：

1) 不同耕作处理平均颜色变化率(AWCD)呈现出以下变化规律：撂荒(LF) > 免耕(NT) > 旋耕(RT) > 翻耕(FT)。表明翻耕处理土壤微生物群落代谢最慢，活性最弱。

2) 撂荒、旋耕与免耕处理的土壤微生物群落丰富度指数H、优势度指数D均显著高于翻耕处理；撂荒、免耕与旋耕3种耕作处理的土壤微生物群落丰富度指数H、均匀度指数E和优势度指数D均无显著差异。

3) 主成分分析结果表明，不同耕作处理条件下华北农田土壤微生物利用的主要碳源是糖类、氨基酸类、代谢物类及次生代谢物类；撂荒和旋耕秸秆还田对微生物碳源利用类型相似，免耕和翻耕各为一组。

4) 旋耕秸秆还田和撂荒有利于提高土壤微生物代谢活性和土壤微生物群落功能多样性，翻耕不利于提高土壤微生物功能多样性。

基金项目

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(农业部环境保护科研监测所2012-szjj-lhm)资助。

文章引用

刘红梅,张贵龙,皇甫超河,杨殿林,赵建宁. 不同耕作方式对农田土壤微生物功能多样性的影响
Effects of Different Tillage Methods on Functional Diversity of Soil Microbial Community[J]. 农业科学, 2016, 06(01): 1-9. http://dx.doi.org/10.12677/HJAS.2016.61001

参考文献 (References)