Asian Case Reports in Veterinary Medicine
Vol.07 No.03(2018), Article ID:25847,9 pages
10.12677/ACRPVM.2018.73005

Research Progress on Diagnosis and Prevention of Duck Tembusu Virus Disease

Kaimin Wang1*, Guoqiang Chen2*, Yunfeng Long1, Jun Luan1, Lei Chen1, Yan Jiang1, Changyin Zhang1, Taishan Tang1

1Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing Jiangsu

2Suzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Suzhou Jiangsu

Received: Jun. 27th, 2018; accepted: Jul. 6th, 2018; published: Jul. 12th, 2018

ABSTRACT

Duck Tembusu virus disease is caused by the Duck Tembusu Virus (DTMUV), which is characterized by retarded growth, rapid egg drop and moderate mortality in ducks and goose flocks. DTMUV infection was first reported in April 2010 in Southeast China, which spread rapidly and resulted in high morbidity rates and acute onset, leading to great economic loss for the duck industry. Based on the data of scholars at home and abroad in recent years, the diagnostic methods and control techniques were reviewed in this paper, in order to provide reference for the prevention and control of the disease.

Keywords:Duck Tembusu Virus, Diagnostic Methods, Vaccine, Control Measures

鸭坦布苏病毒病的检测及防治研究进展

王凯民1*,陈国强2*,龙云凤1,栾军1,陈雷1,姜焱1,张常印1,唐泰山1

1江苏出入境检验检疫局,江苏 南京

2苏州出入境检验检疫局,江苏 苏州

收稿日期:2018年6月27日;录用日期:2018年7月6日;发布日期:2018年7月12日

摘 要

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus, DTMUV)引起鸭、鹅等多种禽类以采食量下降、产蛋下降和伴有一定死淘率为特征的传染病。该病于2010年4月在我国首次暴发,发病急、传播快、发病率高,给鸭养殖户造成了巨大的经济损失。本文结合近年来国内外学者对该病的研究资料,对鸭坦布苏病毒病的实验室检测方法和防控措施研究进展进行了综述,旨在为该病的防治提供参考。

关键词 :鸭坦布苏病毒,诊断方法,疫苗,防控措施

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1. 引言

2010年4月,我国东南沿海地区包括福建、山东、浙江、上海和江苏等地鸭群中突然出现一种以种鸭和蛋鸭产蛋急剧下降为主要特征的传染性疾病,鸭感染后表现为站立不稳,卧地不起等神经症状,病理解剖可见卵泡膜出血、充血和卵泡变形、萎缩以及破裂 [1] [2]。较短时间内,该病迅速蔓延至我国内陆如河南、安徽等地,据估计2010年全国感染该病的蛋鸭高达12亿只、肉鸭1.5亿只,经济损失达数十亿,给我国家禽产业造成了巨大的打击 [3] [4]。经国内多个研究团队病毒分离与鉴定确认该病的病原为黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)中的坦布苏病毒(Tembusu virus),将其命名为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV) [3]。DTMUV的基因组为单股正链RNA,全长约11 kb,共编码3种结构蛋白(囊膜蛋白E、前膜蛋白PrM和衣壳蛋白C)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。同其它已知黄病毒一样,DTMUV的E蛋白为病毒主要的抗原蛋白,介导病毒颗粒与宿主细胞受体的结合和促进二者融合,决定了病毒的亲嗜性及毒力,含有多种抗原表位,能诱导机体产生中和抗体 [5] [6]。

根据鞠明璐 [7] 对来自7个省份的534个蛋鸭场进行的调查研究结果,鸭坦布苏病毒病传播速度快、发病率高,一般死亡率低,为5%~10%,最高达20%,该病的发病率随着蛋鸭日龄增加而升高,处于产蛋高峰的蛋鸭发病率高达80.5%;鸭坦布苏病毒病的发病呈现明显的季节性,其中9~11月的秋季发病较多,可能与传播该病的节肢动物生活史相关。自2010年DTMUV暴发流行后,研究学者陆续从收集自我国的库蚊 [8] 、鸭 [1] 、鹅 [9] 、鸡 [10] 、鸽子 [11] 、麻雀 [12] 中分离出该病毒,可见其致病范围较广。我国具有悠久的养鸭历史,养鸭业是我国家禽产业和畜牧业的重要组成部分,我国是世界上鸭饲养量最大的国家,成年蛋鸭存栏量和肉鸭年出栏量约占世界总量的72% [13] [14]。鸭坦布苏病毒病发病急、传染速度快、发病率高、产蛋下降幅度大且难以恢复,自2010年暴发流行以来,已成为严重威胁我国家禽产业健康发展的一种重要传染性疾病,因此对该病的准确诊断和有效防治措施开展研究尤为重要。2010年以来,科研工作者对鸭坦布苏病毒病的诊断技术及防治措施进行了大量研究并取得了显著成绩,本文进行综述如下。

2. 诊断方法

2.1. 临床诊断

鸭感染DTMUV后,采食量迅速下降,至少减少50%,产蛋量急剧下降至20%左右,部分病鸭出现体温升高,反应迟钝、排绿色水样粪便;严重者出现神经症状,表现为双腿瘫痪,步态不稳;病鸭零星死亡,剖检病死鸭的病理变化主要为卵泡充血、出血、萎缩和变性,肺、脾、肝有出血点,肝脏和脾脏肿大,胰腺出血和坏死,输卵管存在大量黏液,部分鸭只盲肠内容物呈现污绿色或黑色,恶臭 [15] [16] [17]。结合临床症状和病理变化可进行初步诊断,但还要依赖于实验室诊断方法进行最终判定。

2.2. 病毒的分离与鉴定

病毒的分离与鉴定是最经典、最准确的病原学检测方法,可分离得到活体病毒,对病毒的深入研究具有重要意义,但是该方法周期长,操作复杂,不适用于快速诊断。感染病鸭的卵巢、脾脏、肝脏和脑等病变组织均可作为分离DTMUV的样本,加无菌PBS或生理盐水将组织病料充分研磨后经反复冻融、低速离心、过滤除菌步骤后采用尿囊腔接种9~12日龄鸭胚或9~10日龄SPF鸡胚,盲传1~2代,收集尿囊液接种鸭胚成纤维细胞培养,可分离得到DTMUV [18] [19] [20]。曹宗喜 [18] 等从某鸭场的疑似鸭坦布苏病病死鸭中分离到1株病毒,并对该毒株进行PCR鉴定和序列分析,结果显示,分离株的序列与GenBank上登录的DTMUV序列的同源性在99%以上。李方韬 [19] 等人从山东省某种鸭场送检的鸭胚中分离到一株DTMUV,SDBZ株,该病毒可引起鸭胚组织器官病变,致胚胎死亡并呈现出血性水肿。王宾宾 [20] 等人从2015年采集自浙江鸭养殖场的病鸭卵巢病料分离得到2株DTMUV,经全基因组测序后进行比对分析,与GenBank中的19株DTMUV参考序列相比,在核苷酸水平和E蛋白氨基酸水平上,其同源性分别大于97.1%和98.4%。

2.3. 分子生物学检测方法

分子生物学检测技术主要有逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR),套氏RT-PCR,实时荧光定量PCR和逆转录环介导等温扩增技术(RT Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)等,因具有快速、灵敏及特异性强等优点,已成为实验室常用的病原学检测手段。

2.3.1. 常规RT-PCR

目前对于DTMUV的常规RT-PCR方法,主要是针对E蛋白及非结构蛋白NS1、NS3及NS5等基因保守区域设计特异性引物建立的RT-PCR方法。万春和等 [21] 根据黄病毒NS5蛋白编码区的保守区域设计特异性引物,建立了检测DTMUV的RT-PCR方法,该方法具有良好的特异性,最低可检测到20 pg的病毒核酸。王建昌等 [22] 针对DTMUV的E蛋白编码区保守区域设计引物,建立了一步法RT-PCR,该方法最低可以检测到103拷贝/μL的DTMUV核酸。

2.3.2. 套式RT-PCR

为提高检测的特异性和敏感性,有学者在RT-PCR方法的基础上建立了套氏RT-PCR,如在E蛋白编码区设计两对特异性引物,通过两次PCR扩增获得DTMUV特异性片段,敏感性比普通RT-PCR方法提高了10倍 [23]。

2.3.3. 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是一种敏感性高、特异性强,并能对检测样品进行定量分析的PCR方法。李庆阳等 [24] 针对DTMUV保守基因片段设计特异性引物和Taq Man探针,建立的DTMUV实时荧光定量PCR,比常规PCR方法敏感性提高了至少100倍,可用于DTMUV的检测和定量分析。刘洋等 [25] 采用TaqMan荧光标记探针技术,针对DTMUV JXSP株的保守囊膜蛋白E基因建立了快速检测DTMUV的实时荧光RT-PCR方法,试验证实该方法不会对禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒等11种家禽流行病病毒发生非特异性扩增,灵敏度可达20拷贝/反应,可用于DTMUV的快速诊断和大规模检测。Yan等 [26] 建立的DTMUV E蛋白基因特异性的TaqMan探针荧光定量RT-PCR,敏感性是常规RT-PCR的100倍。

2.3.4. RT-LAMP方法

LAMP是由Notomi等 [27] 建立的一种新型核酸扩增技术,其工作原理是针对目的基因六个区域设计四条引物,通过链置换Bst DNA聚合酶在恒温条件下短时间内实现指数级的扩增,可通过肉眼观察判定结果,具有高特异性和高灵敏度。Wang等 [28] 针对DTMUV E基因保守区域设计了一套特异性引物,建立的RT-LAMP检测方法敏感度比常规RT-PCR高,检测限为2拷贝/μL。吴植等 [29] 根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因高度保守区设计了一套引物,通过优化反应体系各组分浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法,试验结果显示该方法的灵敏度是常规RT-PCR的100倍。该方法虽然在检测敏感性上不如荧光定量PCR,但其所需检测设备简单,特异性好,试验周期短,更适合野外现场和实验条件有限的基层机构使用。董嘉文 [30] 等针对DTMUV E基因保守区域设计LAMP引物,结合实时荧光技术建立了DTMUV特异性的实时荧光RT-LAMP检测方法,该方法在反应前加入饱和荧光染料SYTO-9,在ABI 7500荧光定量PCR仪中进行反应,荧光信号的累积与LAMP产物形成同步进行,只需根据扩增曲线判定结果,灵敏度是传统RT-PCR方法的100倍,因且不易形成气溶胶污染,有效避免了假阳性问题,满足疾病准确诊断要求。张伟等 [31] 针对DTMUV E基因保守区域设计引物建立了DTMUV RT-LAMP检测体系,并对比使用荧光染色剂SYBR Green Ⅰ和钙黄绿素、锰离子对扩增产物的可视化判定,SYBR GreenⅠ的显色敏感性为10拷贝/μL,钙黄绿素和锰离子组合显色极限为1000拷贝/μL,敏感性较SYBR GreenⅠ低,但其能有效避免交叉污染且操作简便,适合用于条件相对落后的基层实验室检测。

2.3.5. 多重RT-PCR检测方法

多重PCR能够同时检测和鉴别多种病原,在多种病原混合感染可能时的鉴别诊断中具有快速、便捷等优势,临床应用价值高。孙敏华等 [32] 建立了一种能够同时检测引起家禽产蛋下降的鸭坦布苏病毒、H9亚型禽流感病毒、产蛋下降综合征病毒三种病原的荧光定量PCR检测方法,经过对临床样品的检测结果说明三重荧光PCR方法比常规PCR敏感性高。李海琴 [33] 等建立了同时检测H5、H9亚型禽流感病毒和DTMUV的三重PCR检测方法,对临床200份样品的检测结果证明该方法快速、敏感、特异性强,适用于临床检测应用。张艳芳 [34] 等根据DTMUV E基因和鸭瘟病毒(DPV)UL6基因保守区域设计引物建立同时检测两种病毒的RT-PCR方法,特异性良好,不与鸭新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒发生非特异性反应,能同时检出500 fg的DTMUV和600 fg的DPV,敏感性高,满足临床检测要求。

2.4. 血清学检测方法

2.4.1. 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

ELIA检测方法具有快速、高通量、敏感性高、特异性强等优点,已成为DTMUV血清学诊断的常用方法。王善辉等 [35] 利用杆状病毒表达系统,将DTMUV E蛋白基因在昆虫细胞中表达以获得更接近天然构想且能最大限度保留抗原表位的重组蛋白,并以该重组蛋白建立了DTMUV抗体特异性检测的间接ELISA方法,同时使用全病毒作为包被抗原的间接ELISA检测方法对来自江苏的135份樱桃谷鸭血清样品进行检测,两者符合率为93.1%。傅秋玲 [36] 等截短表达DTMUV E蛋白的主要优势抗原表位E1蛋白并以此为包被抗原建立间接ELISA检测方法,对来自福建省的237份麻鸭血清样品进行初步应用,通过与以全病毒作为包被抗原的间接ELISA检测方法比较,两者符合率为95.1%,可用于监测我国鸭坦布苏病毒疫苗的免疫效果。中国农业科学院上海兽医研究所科研人员建立的间接ELISA血清学检测方法简便快速,易于标准化,适于大规模样品的初步筛查 [37]。瑞普(保定)生物药业有限公司与中国农业科学院上海兽医研究所合作对该方法进一步优化并实现了生产转化,研制了DTMUV间接ELISA抗体检测试剂盒,初步应用试验结果表明,该试剂盒特异性好、敏感性高,可以检测到DTMUV感染后3 d的鸭血清DTMUV抗体转阳。在对300份临床样品的检测中,该检测试剂盒与中和试验总符合率为94.0% [38]。

黄病毒属中各个病毒E蛋白具有相似性,因此各个病毒血清存在一定交叉反应性,利用DTMUV E蛋白或纯化的灭活病毒作为包被抗原建立的ELISA血清学检测方法均存在黄病毒阳性血清交叉问题,为鸭坦布苏病毒病的确诊造成了困难 [39] [40]。李晨曦 [41] 等人以纯化的单克隆抗体1A5为筛选分子,采用噬菌体展示技术鉴定DTMUV E蛋白的特异性抗原表位,再利用DNAStar软件分析该表位序列在DTMUV中的保守性以及同其它黄病毒E蛋白相应位点的氨基酸序列相似性,成功筛选出DTMUV E蛋白的一个高度保守的线性抗原表位87YAEYI91,利用该表位建立Epitope-ELISA血清学检测方法,同时使用中和试验作为标准通过对126份鸭血清样品进行检测对比,结果证实Epitope-ELISA检测方法相对特异性为100%,相对敏感度为96%,但在该方法中反应的亲和力有待进一步提高。Chen等 [42] 以2种DTMUV E蛋白特异性单克隆抗体建立了双抗夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,不与鸭瘟病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、鸭1型肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒发生非特异性反应,同时采用RT-PCR方法检测191份临床样本,二者符合度85.8%。

2.4.2. 乳胶凝集试验

乳胶凝集试验(LAT)操作简便、不需要特殊仪器设备,可在1~5 min内肉眼观察结果,已广泛用于畜禽传染病的血清学检测。万春和 [43] 等以浓缩纯化的DTMUV为检测抗原,通过与特异性DTMUV阳性血清反应后出现肉眼可见的凝集颗粒而建立了DTMUV抗体乳胶凝集检测方法,经试验证实该方法具有良好的特异性;同时采用间接ELISA方法对80份鸭血清进行检测,二者符合率为85.3%,因乳胶凝集试验简便、快速、特异等优点,可用于临床样品的快速诊断。

3. 防治措施

3.1. 灭活疫苗

病毒灭活疫苗主要是采用甲醛、β-丙内酯(BPL)等灭活剂对病毒培养液进行灭活处理后,加入适宜的佐剂进行乳化制备而成。灭活疫苗具有良好的安全性和稳定性,应用广泛。高旭远 [44] 等使用DTMUV弱毒株(FX2010-180P)作为种毒,选用甲醛和BPL两种灭活剂灭活后,与佐剂Montanide ISA 50V2乳化后形成油包水型灭活疫苗,免疫效力评价试验结果说明抗原含量高低影响着免疫效力,抗原含量高,则诱导产生抗体时间较早,抗体滴度也较高;试验结果还提示BPL灭活的疫苗组免疫效力更好,对鸭保护率高达100%。张聪 [45] 等人制备的重组融合肽Tα1-BP5(胸腺肽α1和法氏囊活性肽BP5的融合肽)与DTMUV灭活疫苗联合使用同单独使用疫苗或单肽+疫苗进行比较,机体体液免疫水平、细胞免疫水平和肝保护效果明显增强,说明重组融合肽Tα1-BP5具有良好的免疫佐剂效果。有学者对北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普生物药业有限公司研制的鸭坦布苏病毒灭活疫苗(HB株)进行了系列研究:韩春华 [46] 等用该灭活疫苗对开产前的樱桃谷肉鸭种鸭进行免疫,再将种鸭产的种蛋进行孵化,最后通过抗体检测和攻毒保护试验来研究雏鸭的母源抗体效价和消长动态,研究结果说明该灭活苗母源抗体能够保护10日龄内雏鸭,疫苗首免时间在7~10日龄最佳。段会娟 [47] 等主要探索了该疫苗对北京鸭的免疫产生期和持续期,并评价和比较了不同接种途径的保护效力,研究结果证实该灭活苗对16日龄北京鸭进行二次免疫后7天可测到血清抗体阳性并产生良好的保护效果,皮下注射和胸部肌肉注射途径的免疫持续期分别为60天和100天,说明胸部肌肉注射途径更佳。何平有 [48] 等对5个批次GMP车间生产的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)的安全性和效力进行了临床评价,采用双倍剂量免疫樱桃谷鸭、北京鸭雏鸭和产蛋北京鸭,均没有出现明显免疫副作用;免疫后14天血清抗体出现转阳,转阳率在40%~80%,免疫28~135天,转阳率超过90%,免疫后28天和135天的攻毒血清病毒分离率和卵巢病变率减少80%以上,说明该灭活苗具有良好保护效果,可用于临床防治。该疫苗已于2016年获得国家新兽药证书。

3.2. 弱毒活疫苗

于可响等 [49] 将鸭坦布苏病毒山东分离株 BZ_2010在SPF鸡胚上进行连续传代致弱,传代过程中毒价逐渐升高,实验证实经过120次传代培养的VC2毒株对1日龄雏鸭和30周龄产蛋种鸭已完全丧失了致病力,毒力返强试验中5代内未出现任何返强迹象;接种免疫后,鸭体内抗体水平上升快,维持时间长、衰减缓慢,基本可以维持整个产蛋期。在病毒滴度5.5lgTCID50时不能在鸡胚中增殖,且不能感染小鼠和麻鸭。Guoxin Li等 [50] 将DTMUV强毒株FX2010在鸡胚成纤维细胞中连续传代180次,获得一株减毒株FX2010-180P,以5.5log10TCID50剂量感染鸭不会出现临床症状和任何病理损伤;在低剂量3.5log10TCID50条件下能诱导机体产生有效免疫反应并在攻毒试验中表现出完全保护作用;对减毒机制研究发现,FX2010-180P毒株出现了19个氨基酸改变和15个同义突变位点,其中非结构蛋白NS1、NS3、NS4A、NS4B和NS5发生的10个突变位点出现在较高代次病毒,正好是病毒失去体内增殖能力的时间点。E蛋白第120、312、349位和NS1-262、NS3-322氨基酸改变发生在在第60代,推测可能与病毒的神经毒性和神经侵染性相关,因为突变后的病毒没有出现在感染鸭的脑组织中。吴晓刚 [51] 等对减毒疫苗株FX2010-180P毒种低温保存进行了研究,–80℃低温保存16个月后,病毒滴度没有明显下降,免疫原性保存良好,毒种增殖病毒以101.5TCID50剂量接种仍然可以为90%的接种鸭提供保护。韩建文 [52] 等将鸭瘟鸡胚化弱毒活疫苗与鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗(FX2010-180P株)联合使用,肌肉注射途径接种21日龄健康肉鸭,没有出现不良副反应,血清抗体检测结果证实两种疫苗联合使用所产生的抗体水平高于单独免疫。齐鲁动物保健品有限公司研制成的DTMUV WF100株弱毒活疫苗,已于2016年获得国家新兽药证书。

3.3. 基因工程疫苗

Chen等 [53] 以减毒活疫苗的鸭肝炎病毒(DEV)为载体,分别构建了表达DTMUV囊膜蛋白的重组病毒rDEV-TE以及同时表达DTMUV囊膜蛋白和前膜蛋白的重组病毒rDEV-PrM/TE,动物实验证实这两种重组病毒均能引起鸭产生TDMUV中和抗体,攻毒试验中rDEV-PrM/TE组保护率为100%。邹忠等 [54] 以鸭肠炎病毒为载体,运用CRISPR/Cas系统将禽流感病毒H5N1的主要免疫原性基因HA和DTMUV的E蛋白基因、PrM基因插入鸭肠炎病毒的基因间隙,构建鸭肠炎病毒-鸭禽流感-鸭坦布苏病毒基因工程三价疫苗,为鸭的这三种疾病预防提供了有利武器。

3.4. 卵黄抗体的制备与应用

卵黄抗体是一种广泛应用于家禽、家畜以及人类疾病诊断和防治方面生物制剂,对病毒性疾病治疗有独特优势 [55]。胡紫霞 [56] 鸭坦布苏病毒AH-F10株灭活病毒免疫高产蛋鸡,制备抗鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体,经过人工攻毒试验证实卵黄抗体对鸭坦布苏病毒病具有良好的预防和治疗作用。赵瑞宏等 [57] 使用AH01株DTMUV作为抗原3次免疫产蛋母鸡,收集鸡胚后制备出高免卵黄抗体,具有良好的安全性,对DTMUV具有明显的中和作用,能有效保护鸡胚、雏鸭和产蛋鸭。王领兄等 [58] 制备的DTMUV特异性高免卵黄抗体,琼脂扩散试验抗体效价为1:64,对DTMUV强毒株攻毒保护率达100%。卵黄抗体制备成本低、产量高、安全有效,可广泛运用于DTMUV的防治。

3.5. 药物研究

对于该病,目前尚无特效治疗药物,通常在发病早期采用DTMUV卵黄抗体、康复鸭血清或高免血清进行紧急预防或治疗。陆新浩等 [59] 对5种常用的抗病毒药物(金刚乙胺、脱氧若卡素钠、病毒灵、利巴韦林、阿昔洛韦)进行体外抗鸭坦布苏病毒的药物筛选试验,结果表明利巴韦林在体外对鸭坦布苏病毒具有抗病毒作用,而其余4种药物对该病毒无明显抗病毒作用。

4. 结语

自2010年以来,DTMUV的流行成为了困扰我国家禽养殖业发展的一大难题,因该病毒传播迅速、发病率高,种鸭、蛋鸭感染后产蛋量下降幅度大,恢复难,经济损失惨重。目前,对DTMUV的研究还有很多问题有待解决,首先,进一步开展DTMUV的分子流行病学调查是研究该病毒的重点工作之一,这对追溯该病毒的起源与进化具有重要意义。其次,应加快对该病的传播途径方面的研究,以便实施有效的预防措施。最后,对于DTMUV的基因功能、遗传变异和致病性等方面的研究能揭示病毒在传播过程中的突变及毒力变化、病毒与宿主细胞之间的相互作用等机制,将有助于研制出特异性的治疗药物和疫苗。

基金项目

2016年国家质检总局科技计划项目2016IK132。

文章引用

王凯民,陈国强,龙云凤,栾 军,陈 雷,姜 焱,张常印,唐泰山. 鸭坦布苏病毒病的检测及防治研究进展
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NOTES

*通讯作者。

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