¹济宁医学院临床医学院，山东 济宁

²济宁医学院附属医院妇科，山东 济宁

收稿日期：2023年2月13日；录用日期：2023年3月9日；发布日期：2023年3月15日

摘要

宫颈癌是女性群体的高发疾病之一，我国每年宫颈癌新发病例约10万例，是威胁女性健康的重大疾病。宫颈癌筛查是促进其早诊断早治疗的有效措施，基于细胞学的检测是以往筛查方案的基石，但近年来国内外均建议选择基于HPV的检测作为初级筛查的方案之一，随着对人乳头瘤病毒(HPV)检测方法的更新，各种检测方法的优缺点及适用范围均需得到进一步剖析，本文将对其进展展开研究与讨论。

关键词

人乳头瘤病毒，HPV检测，宫颈癌筛查，分子标志物，综述

The Research Progress Laboratory Diagnostics Methods of Human Papillomavirus

Junjun Liu¹, Baolin Xu¹, Li Zhang^2*

¹Clinical Medical College, Jining Medical University, Jining Shandong

²Department of Gynecology, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining Shandong

Received: Feb. 13^th, 2023; accepted: Mar. 9^th, 2023; published: Mar. 15^th, 2023

ABSTRACT

Cervical cancer is one of the high-incidence diseases in the female population, and there are about 100,000 new cases of cervical cancer in China every year, which is a major disease that threatens women’s health. Cervical cancer screening is an effective measure to promote its early diagnosis and early treatment, cytology-based detection is the cornerstone of the previous screening program, but in recent years, it is recommended to choose HPV-based detection as one of the primary screening programs at home and abroad, with the update of the human papillomavirus (HPV) detection method, the advantages and disadvantages of various detection methods and the scope of application need to be further analyzed, this article will carry out research and discussion on its progress.

Keywords:Human Papillomavirus (HPV), HPV Detection, Cervical Cancer Screening, Molecular Markers, Review

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

宫颈癌的发病率居我国女性恶性肿瘤的第2位，我国每年宫颈癌新发病例约10万例，防治形势相当严峻 [1] 。开展宫颈癌筛查是促进宫颈癌早诊断早治疗的有效措施，也是我国基本公共卫生服务重点项目。随着宫颈癌筛查的逐渐普及、女性对健康意识的提高，对宫颈癌筛查方法进行评估至关重要。宫颈癌通常由低级别或高级别的鳞状上皮内病变演变而来，因此早期宫颈癌筛查对预防宫颈癌的发生发展显得十分重要 [2] 。基于细胞学的检测一直是以往筛查方案的基石，然而，由于高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染是导致女性宫颈癌的主要元凶，且HPV检测比细胞学检查具有更高的敏感性和可重复性，因此近年来欧洲指南强烈推荐选择基于HPV的检测作为初级筛查的首选 [3] 。2022年我国国家卫健委发布的《宫颈癌工作筛查方案》也明确提出可以使用基于高危型HPV的检测作为初筛方案之一。本文对目前国内外HPV筛查方法的研究进展进行综述，探讨各种HPV检测方法的临床应用价值。

2. HPV感染致病原理

HPV病毒由早期基因、晚期基因和一个不翻译的上游调节区3部分组成，它对鳞状上皮具有趋向性，因此可引起皮肤或者粘膜的感染。早期基因E1~E7分别编码E1~E7蛋白，HPV DNA的整合可引起病毒基因E6和E7调节异常，使正常细胞向恶性转化。E6和E7蛋白可分别通过黏附肿瘤抑制因子p53和pRB基因使细胞生长抑制基因失活 [4] ；此外，有相关国外学者发现，HPV16，18，62，84的E6E7蛋白上调了IL-6细胞因子的过度表达，导致促炎症与高度增殖的微环境，增加细胞癌变发生的可能性，低风险病毒中虽然也有IL-6的表达，但上调幅度不大 [5] 。因此，如何发现HPV病毒的感染状态，并着重于高危型HPV的检测，有助于降低阴道镜的过度检查，提高宫颈癌筛查的敏感性。

3. 目前已有筛查项目及其特点

3.1. HPV-DNA检测

在2021年世界卫生组织发布的关于预防宫颈癌的癌前病变筛查与治疗指南中指出：无论是在一般人群还是HIV感染患者中，均建议使用HPV DNA检测作为初筛项目。与细胞学筛查相比，它不依赖于结果的形态学解释、具有更长的筛查间隔时间，利于节省医疗资源 [6] 。在M. Arbyn等人在2020年适用于初级宫颈癌筛查的HPV检测清单中指出 [7] ：hrHPV DNA检测完全符合当前标准，在今天使用临床医生收集的宫颈样本进行基于HPV的宫颈癌筛查时可以推荐使用的方法有：HC2、GP5+/6+ PCR-EIA、Abbott RealTime、Alinity、Anyplex HR、Cobas 4800 PapilloCheck、Onclarity、HPV-Risk and Xpert HPV。这些方法具有具有各自不同的特点及适用性。

3.1.1. HC2 (杂交捕获法2代)

该方法是一种基于杂交的固体检测，作为FDA批准的第一种HPV诊断方法(2003年)，属于第一代检测技术，使用RNA探针与HPV DNA杂交，可以检测出13种高危型HPV (16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/ 58/59/68)；5种低风险类型(6/11/42/43/44)；但却不能确定具体亚型 [8] ，在一项对同一人群和同一样本进行的HC2和Cobas测试的平行比较发现，检出的HPV阳性率分别为9.8%和7.4% (p < 0.0001)，后期通过L1和E6/E7基因分型，发现约80%的不一致样本(HC2阳性/Cobas阴性)为HR-HPV阴性，所以HC2检测出的非HR-HPV类型(与非HR-HPV类型的交叉杂交)增加了其HPV检测阳性率 [9] 。

3.1.2. careHPV检测

其工作原理与HC II相同，同为第一代检测技术，使用便携式和自动化检测仪器。检测系统使用电池作为电源，测试时不需要额外的试剂，操作简单，但其检测范围仅包括14种高危亚型，它适用于偏远、欠发达和农村地区 [10] 。

3.1.3. GP5+/6+PCR

基于PCR的GP5+/6+酶免疫分析(EIA)是经临床验证用于初级筛查的HPV测试之一，有学者提出 [11] 同样基于GP5/6PCR的LMNX基因分型试剂盒，表现出与EIA同等的临床效益。此外，LMNX具有高输出量和对hrHPV进行全基因分型的能力，可能有助于识别特定类型的持续性HPV感染，而且测试性能和样品质量可以通过使用内部对照来验证。但其全基因分型的价值尚不清楚，而且hrHPV检测的临床验证国际指南规定，样本应来自于结合或不结合细胞学检测的筛查队列，其研究仅使用了一个基于细胞学的筛查队列。

3.1.4. 线性阵列HPV基因分型分析(Linear Array Genotyping Test)

为第二代检测技术，采用集合引物组与固定在尼龙条上的37种HPV基因型的特异性探针进行杂交，来鉴定37种HPV基因型，在同行评议的文献中拥有最丰富的数据，被列为最经常使用的测试之一，但因其操作复杂，容易造成PCR产物污染，主要用于HPV流行病学研究，在临床环境中很少使用 [10] ，同时有研究表明 [12] HPV基因型86、87和114在LA测试中与HPV84交叉杂交，HPV102与HPV83探针交叉反应，从而导致了其测验中HPV 83和84型的感染率被高估。

3.1.5. Cervista HPV HR检测法

它是一种基于实时定量PCR的HR-HPV检测方法，由Cleavase酶特异性的识别并切割目标 DNA，通过信号放大直接检测特定核苷酸序列，无须基因扩增。其优势主要在于，可以将HPV16和18与其他高危亚型区分开来，与HC2试验相比，对HR-HPV具有更高的分析特异性 [13] ；并且可评估细胞样本是否充足，对降低筛查的假阴性率有重要的意义。但该方法仅被FDA批准用于30岁或30岁以上的女性，作为对14种高危HPV类型的阳性HPV筛查的随访测试 [14] 。除此之外，同样也无法确定为哪种亚型感染 [8] 。

3.1.6. Cobas

cobas 4800 HPV检测是一种基于PCR的实时检测方法，属于第三代检测技术，是一项经临床验证的HPV筛查试验。它识别HPV 16/18型，检测出的12种HR-HPV类型(31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68)归为非HPV16/18型组。在一项临床试验中表明：它具有比HC2更高的特异性，可降低假阳性率及阴道镜转诊率 [9] 。它是目前在美国唯一被批准用于25岁以上的HPV初筛的测试 [8] 。上述研究中发现：HPV68型是HC2和Cobas的目标类型，但约10%的不一致样本(HC2阳性/Coba阴性)在RLB分型中呈HPV68a阳性(没有HPV68b阳性病例)，因此，此研究尚不能确定Cobas检测HPV68a和HPV68b是否具有相同的灵敏度 [9] ，仍有待大量临床数据证实。另有研究 [15] 提示由p 480 v2和cobas 6800仪器组成的新cobas平台上进行的HPV检测，结果显示与正在使用的cobas 4800系统高度一致，具有较高的内部和内部可重复性，同时在工作流程和实验室生产率方面具有较高的性能，其适合用于以人口为基础的宫颈癌筛查项目中的大型集中式实验室。

3.1.7. MeltPro^®HPV检测试剂盒

在当前几代检测方案以外，国外有学者建议使用MeltPro®HPV检测试剂盒，这是一种在实时PCR平台上工作的半自动全hrHPV基因分型分析，它可以在一次反应中单独鉴定14种hrHPV基因型，并且在从偏远和不发达地区到大型筛查中心的各种环境中都很强大，结合了第一代的简单性、第二代的完整基因分型能力和第三代的自动化操作，还具有成本低和易于使用等额外的优点，已用于HPV流行病学研究以及各种条件下HPV疫苗接种策略的预研究，但在应用于宫颈癌前筛查之前，仍需根据Meijer的国际指南和VALGENT或VALHUDES方案对其进行进一步验证研究 [10] 。

3.1.8. BD OnclarityTMHPV检测法(Onclarity)

是由Becton Dickinson最近开发的一种检测hrRHPV的新方法，属于第三代检测技术，于2018年为FDA批准，这是一种基于RT-PCR和荧光探针技术的定性靶向扩增试验，用于检测HPV基因组的E6和E7 DNA区域，同时检测13种高危型和一种可能致癌的HPV基因型(HPV66)，提供了六种单独基因型(HPV 16, 18, 31, 45, 51, 52)的基因分型信息，并将其余的HPV基因型分成三个不同的组(33/58、35/39/68和56/59/66)。其扩展基因分型能力便于对HPV阳性的妇女进行更精细的管理，所使用的Viper LT仪器操作方便，试剂可在室温下储存，测试完全自动化，满足对HPV检测的敏感性和特异性要求。其缺点为不是所有的HPV基因型都被单独报告，各组的阳性率可能会对解释产生混淆 [16] 。

3.1.9. PEI-NWs检测尿HPV

国外一项基于使用聚乙烯亚胺结合聚吡咯纳米线(PEI-NWs)检测尿液HPV研究提出 [17] ：宫颈癌的发生通常伴随着HPV DNA插入癌细胞基因组，假设此步骤会诱发热力学或结构不稳定，从而在突变点附近产生游离DNA (cfDNA)，导致癌症患者液体样本(如血浆、痰液、尿液)中cfDNA的水平升高。PEI-NWs能分离出尿液中的cfDNA使得相关的探针能够进入并与互补的目标序列进行杂交，而不需要热变性步骤，即使使用少量尿液(200 μL)也可以分离和检测多种致癌HPV基因型，其检测尿液和宫颈拭子之间的hrHPV一致率高达90.4%。然而，目前仍需要进行更多的研究来评估其检测宫颈癌前病变或CIN2/3+的临床准确性；以及在更大的队列中进行进一步验证，以区分高危HPV人群。

3.2. 分子标志物相关检测

3.2.1. HPV E6/E7mRNA检测

据有关学者报道：E6蛋白作用于p53基因，控制基因表达过程中的各个环节。E7基因编码的蛋白结合到肿瘤抑制蛋白Rb上而引起了Rb降解，激活相关基因使细胞呈增殖状态。宫颈HPVDNA检测阳性只能表明病毒存在，而HPV E6/E7mRNA检测阳性可说明病毒已整合入宫颈上皮细胞基因组内并发生了基因表达，处于持续性感染的状态 [2] 。有国外学者提出：HPV E6/E7 mRNA检测对检测CIN2+具有诊断相关性，可以在没有组织学检测设施的地区考虑 [18] 。除具有诊断价值外，由于CIN病变程度与HPV E6、E7 mRNA转录水平间具有相关性，若使用定量检测，可根据其转录数来判断病变的进展程度及细胞的恶性转化，但其定量检测的最佳诊断临界点有待通过大量研究工作统一制定 [19] 。

3.2.2. HPV E6/E7蛋白检测

由于病毒基因E6和E7在宫颈癌发展过程中的特殊作用，有国外学者一项研究中指出：E6和E7蛋白可能是识别HR HPV的关键，成为一种潜在的新的生物标志物 [20] 。在蒋杰等学者 [21] 的研究下指出，对于某些高危型HPV，如16、18型，E6/E7蛋白检测的敏感性要高于E6/E7 mRNA的敏感性。然而，目前并非所有类型的抗E6/E7单克隆抗体均显示出高特异性。所以他也提出可以联合E6/E7 mRNA和蛋白质双重测试方案的或许可以改善筛查的特异性和敏感性。而且接下来仍需要大样本和多中心的临床研究来评估HPV E6/E7蛋白检测的效率，是否可以作为筛查和诊断宫颈癌的新指标。有学者猜测，待HPV E6/E7蛋白检测逐渐成熟，HPV E6/E7蛋白可能是具有令人满意的HPV 16和18型诊断价值的潜在新生物标志物。

3.3. 自采样模式

因为在许多地区，因为文化障碍或者抗拒妇科检查导致大量病人在可治愈阶段延误了诊断与治疗，对于很大一部分从未筛查过或不定期筛查的女性，也可以采取将自采样材料邮寄到家的模式。在一定程度上，它可以提高人口覆盖率，或许可以扩展改良生殖器和宫颈癌症预防策略以及监测和管理生殖器癌前病变的可能性 [22] 。

3.3.1. 阴道自采样

在国外一项医务人员阴道自我取样和宫颈取样检测HPV和CIN2比较的研究中证实 [23] ：将FTA卡作为存储介质联合基于PCR的HPV检测的阴道自采样方式，与医疗专业人员的采样相比，HPV的检测率相似；并且一项大型荟萃分析指出，与临床医生所取样本相比，基于PCR的HPV检测对自身样本中的CIN2和CIN3检测同样敏感，同时考虑到卫生经济学方面，建议可以在宫颈癌初步筛查中考虑应用自身样本。在中国农村实行的一项横断面研究表明 [24] ：自我收集阴道样本进行基于PCR的高危HPV检测试验，后续对HPV阳性者进行HPV 16/18基因分型，阴道镜检查分诊，然后进行热消融治疗可能是中国农村地区合适的筛查措施。该计划降低了成本，能提高筛查覆盖率，同时提高了后续护理的合规性。

3.3.2. 尿液HPV自采样

近年来有国内外学者指出 [22] ，尿液HPV的检测可能成为一种最有前途的工具，它采用患者自采样模式获得生物材料(尿液等)，并随后进行HPV生物标志物检查。不仅具有低成本特点，更是避免了将取样试剂盒插入阴道的动作，其非侵入性具有更加良好的可接受性。但是由于现今缺乏尿液收集、保存、取尿时机及检测方法的标准化，所以暂不能为其广泛使用提供强有力的证据 [25] 。无论国内国外，为了应用以上自采样模式，均应进一步研究替代模式的测试精度和成本效益分析，评估自我抽样在初筛中的可行性和有效性。

对于HPV检测来说，有国内有学者证实：因为取材不标准，受杂质影响或取材过少，或者许多引起致病的亚型并不在检测技术范围之内，或部分特殊类型的宫颈癌患者的疾病发生与HPV病毒并无直接关系，从而造成检测结果的偏倚。而且由于HPV-DNA检测仅能表明患者有无HPV病毒感染，无法证明宿主细胞中有无病毒整合，因此在宫颈高级别病变患者甚至宫颈癌患者中仍存在较高的阴性率 [26] 。

HPV疫苗接种逐渐走入大众视野，新的多价疫苗开发需要最新HPV流行病学数据的支持。在人口流动和社会经济因素的影响下，同一地区流行的HPV基因型可能会发生变化 [10] 。而未来自我取样方法的完善和普及，加上快递物流和移动互联网连接，将改变宫颈癌前筛查的模式。因此，持续而高效的HPV基因型监测对于各个国家和地区至关重要。WHO在《全球消除宫颈癌行动呼吁》中建议，到2030年，每个国家至少应对70%的35岁和45岁的女性进行高性能HPV检测。随着目前学者们对于HPV检测方法的研究以及采样方法的扩展，仍需更多的大样本多中心随机研究来判定最佳的方案。无论是细胞学检查、分子标志物检测，或是HPV相关的检测，单种检测方式均难以达到理想的筛查效果，可以根据本地区医疗资源以及经济水平选择合适的筛查方式，同时保证筛查的推广与质量。

基金项目

济宁市重点研发计划项目(2020YXNS009)。

文章引用

刘珺珺,许宝霖,张 丽. 宫颈人乳头瘤病毒检测方法的研究进展
The Research Progress Laboratory Diagnostics Methods of Human Papillomavirus[J]. 临床医学进展, 2023, 13(03): 3589-3595. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.133514

参考文献