¹山东省农业科学院作物研究所/农村农业部黄淮海薯类科学观测实验站(济南)，山东 济南

²石家庄慧谷农业科技有限公司，河北 石家庄

收稿日期：2022年7月7日；录用日期：2022年8月5日；发布日期：2022年8月12日

摘要

以120份不同甘薯品种试管苗为材料，利用单一RT-PCR和基因芯片两种技术进行病毒检测比较研究。单一RT-PCR结果表明，供试样品中甘薯曲叶病毒SPLCV的阳性率最高，达62.5%；依次是甘薯褪绿矮化病毒SPCSV、甘薯羽状斑驳病毒SPFMV、甘薯G病毒SPVG以及潜隐病毒SPLV。基因芯片在SPLCV、SPCSV、SPFMV及SPVG等4种病毒的检出率结果显著低于单一RT-PCR。因此，单一RT-PCR较适用于试管苗病毒检测，基因芯片快速、便捷、高通量，但是对甘薯病毒的检测尚需进一步优化。

关键词

甘薯，单一RT-PCR，基因芯片，病毒

Application Analysis of Gene Chip and Single RT-PCR in Virus Detection of Sweet Potato Tube Plantlet

Fuyun Hou¹, Huiqing Zhai², Qingmei Wang¹, Zhen Qin¹, Yuanyuan Zhou¹, Aixian Li¹

¹Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observation and Experimental Station of Tuber and Root Crops in Huang-Huai-Hai Region, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Jinan Shandong

²Shijiazhuang Huigu Agricultural Science and Technology Company, Shijiazhuang Hebei

Received: Jul. 7^th, 2022; accepted: Aug. 5^th, 2022; published: Aug. 12^th, 2022

ABSTRACT

120 tube plantlets of sweet potato were used as materials to detect sweet potato virus by single RT-PCR and gene chip. Single RT-PCR results showed that the positive rate of sweet potato curl virus (SPLCV) was the highest up to 62.5%. The detection rates of sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV), sweet potato feathery mottle virus (SPFMV), sweet potato virus G (SPVG) and Sweet potato latent virus (SPLV) decreased successively. The detection rates of SPLCV, SPCSV, SPFMV and SPVG using gene chips were significantly lower than single RT-PCR. Single RT-PCR has strong specificity, good repeatability and good stability. However, single RT-PCR is more suitable for detecting sweet potato virus, gene chip has the characters of fast, convenient and high throughput, but its application in sweet potato is not mature yet and the detection of SPLCV, SPCSV and SPFMV needs further optimization.

Keywords:Sweet Potato, Single RT-PCR, Gene Chip, Virus

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1. 引言

甘薯病毒病已成为制约我国甘薯产业发展的主要因素之一，自2014年开始，甘薯卷叶病毒和甘薯SPVD病毒病复合体在生产上大爆发，发病严重田块产量损失达60%~80% [1]。目前，生产上没有抗病毒的甘薯品种及有效的防控药剂，甘薯茎尖脱毒是解决甘薯病毒病最有效的途径。病毒检测是甘薯茎尖脱毒及健康种薯繁育过程中重要的环节。目前，甘薯病毒常用检测方法主要有血清学检测(ELISA)、指示植物嫁接法、诊断学检测、单一RT-PCR以及基因芯片等 [2] [3]。指示植物嫁接法、诊断学检测主要在甘薯病毒初步鉴定中使用 [4]，单一RT-PCR和基因芯片是甘薯病毒应用较多的检测方法。与血清学检测相比，单一RT-PCR根据甘薯病毒的外壳蛋白或运动蛋白序列设计引物，进行病毒检测，具有灵敏、高效快速等优点 [5]。基因芯片技术则是将分子生物学、信息科学与计算机等技术于一体形成的核酸固相杂交技术，具有高通量、灵敏度高及微型化的优点 [6]。本研究将基因芯片与单一RT-PCR甘薯病毒检测技术进行比较研究，以期为甘薯种苗繁育企业、科研单位对甘薯病毒检测方法提供参考依据。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

龙薯9号、烟薯25、普薯32、济薯25、哈密、商薯19、红瑶、以名门金石等甘薯品种的试管苗，取其带有叶柄的叶片，液氮处理后，−80℃保存备用。

2.2. 酶和试剂

甘薯病毒检测基因芯片试剂盒组GeneTop SPV Kit购自台湾巨合生物有限公司。DNA、RNA提取试剂盒购自山东思科捷生物技术有限公司。

2.3. 基因芯片检测

利用甘薯病毒基因芯片试剂盒进行甘薯SPFMV、SPCSV、SPVG、SPLV、SPLCV病毒检测。核酸的提取按照其试剂盒说明书进行。RT-PCR反应体系：SPV Mix 9.6 μl、Taq酶0.3 μl、RT反转录酶0.1 μl、样品2 μl。PCR反应条件：45℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃，7 min。将RT-PCR产物根据试剂盒说明书进行杂合反应。将芯片结果与对照表对比，判断感染甘薯病毒种类。

2.4. 单一RT-PCR

SPFMV、SPCSV、SPVG、SPLV、SPLCV等5种病毒的特异性引物参照乔奇等(2012) [2]。根据Sparkzol reagent RNA提取试剂盒以及Spark classic植物基因组DNA提取试验盒的操作步骤进行RNA和DNA的提取。利用SparkscriptII RT Plus Kit试剂盒进行第一链cDNA的合成。以第一链cDNA为模板，分别利用5种病毒的特异性引物进行PCR扩增。反应体系如下：cDNA1μL、10×PCRmix (含MgCl₂) 2 μL、正向引物和反向引物各1 μL、ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，补充ddH₂O至总体积20 μL。反应条件：98℃变性10 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，36个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据电泳结果判断感染甘薯病毒种类。

3. 结果与分析

3.1. 5种病毒的单一RT-PCR检测结果

单一RT-PCR检测结果表明，在120份供试材料中，检测出带病毒的株系77份，占64.1%。其中SPLCV的阳性检出率最高，达到62.5% (见表1)；其次是SPCSV的阳性检出率为6.67% (表1)、SPFMV的阳性检出率为5.0% (表1)、SPVG的阳性检出率3.33% (表1)，和SPLV病毒的阳性检出率为0%。

表1. 单一RT-PCR病毒检测结果

^*代表病毒阳性株系数。

3.2. 基因芯片检测结果

利用基因芯片方法对同样的120份供试材料进行病毒检测。结果发现，在所有材料中，2份材料含有SPFMV (见表2)，2份材料含有SPVG病毒(表2)，其余材料均未发现5种病毒(表2)。

表2. 基因芯片病毒检测结果

^*代表病毒阳性株系数。

3.3. 两种检测方法结果比较

从上面的检测结果可以看出，利用两种检测方法中SPCSV、SPFMV、SPVG、SPLCV等4种病毒的检测结果差异显著，其中单一RT-PCR方法的SPLCV阳性检出率达到62.5%。但是，基因芯片的SPLCV阳性检出率为0。由此可以看出，单一RT-PCR在病毒检测中相对较稳定，而使用试剂盒的基因芯片属于多重RT-PCR，敏感度较低。

4. 讨论

目前，应用于甘薯小量样品的病毒检测技术主要有RT-PCR和基因芯片技术。本研究对120份甘薯试管苗同时利用单一RT-PCR、基因芯片技术进行病毒检测，并将结果进行比较分析，结果发现两种检测方法在SPCSV、SPFMV、SPVG、SPLCV等4种病毒的检测结果差异较显著。我们采用的RT-PCR属于单一RT-PCR，相对与多重RT-PCR，单一RT-PCR具有特异性强、重复性好、稳定性好的优点，但是对于多种病毒的检测，单一RT-PCR相对费时、费工。基因芯片技术在马铃薯、苹果、草莓、百合等植物病毒检测中应用较多 [7] [8] [9]，具有快速便捷、高通量的优点 [10]。基因芯片在甘薯病毒检测中应用较少。基因芯片的类型较多，芯片的杂交条件因研究对象、试验材料的不同而不同。目前，本研究所采用试剂盒的基因芯片是根据甘薯5种病毒的外壳蛋白或复制酶序列设计了5条引物和探针，利用多重RT-PCR，再将PCR产物经过杂合反应形成杂交信号。在本研究中，基因芯片在SPCSV、SPFMV、SPVG等RNA病毒及DNA病毒SPLCV等4种病毒的检测结果显著低于单一RT-PCR技术。这说明用于基因芯片的甘薯病毒检测试剂盒还需进一步优化。

5. 结论

对于小样的甘薯试管苗样品，建议根据实际需要，选择单一RT-PCR或基因芯片进行多次检测或2种方法交叉应用，以期提高病毒株检出率，服务甘薯生产。

基金项目

国家甘薯产业技术体系(CARS-10-B06)、泰山产业领军人才工程(LJNY202113)山东省良种工程(2020LZGC004)及山东省农业科学院农业创新工程项目(CXG2022A14)资助。

文章引用

侯夫云,翟会青,王庆美,秦 桢,周媛媛,李爱贤. 基因芯片和单一RT-PCR在甘薯试管苗病毒检测中的应用
Application Analysis of Gene Chip and Single RT-PCR in Virus Detection of Sweet Potato Tube Plantlet[J]. 农业科学, 2022, 12(08): 704-708. https://doi.org/10.12677/HJAS.2022.128100

参考文献