青岛大学附属青岛市市立医院，山东 青岛

收稿日期：2021年9月13日；录用日期：2021年10月6日；发布日期：2021年10月15日

摘要

目的：探讨拓扑异构酶IIA (Topoisomerase IIA, TOP2A)在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)组织中的表达及临床意义。方法：通过GEPIA、UALCAN以及Human Protein Atlas (HPA)数据库分析TOP2A在正常肾组织和ccRCC组织中的表达。通过UALCAN数据库进行TOP2A mRNA与ccRCC临床病理特征的相关性分析。采用GEPIA、Kaplan-Meier及UALCAN分析TOP2A表达与ccRCC预后的关系。通过TIMER数据库分析TOP2A表达与ccRCC免疫水平的相关性。以及通过STRING和Metascape数据库分别进行TOP2A蛋白质互作网络的构建及其功能机制的探索。结果：与正常肾组织相比，TOP2A在ccRCC组织中显著高表达(P < 0.05)，且TOP2A mRNA的表达水平与ccRCC的病理分期、临床分期以及淋巴结分期呈正相关。生存分析显示，TOP2A低表达的患者的总体生存率明显高于高表达患者(P < 0.05)。TIMER数据库分析显示TOP2A的表达与B细胞(r = 0.356, P < 0.01)、CD4⁺ T细胞(r = 0.232, P < 0.01)、CD8⁺ T细胞(r = 0.285, P < 0.01)、巨噬细胞(r = 0.304, P < 0.01)、中性粒细胞(r = 0.43, P < 0.01)以及树突状细胞(r = 0.466, P < 0.01)的免疫浸润水平呈正相关。此外，通过STRING数据库构建了TOP2A蛋白互作网络，富集功能分析显示TOP2A及其相互作用的基因主要参与细胞代谢过程、正负向调节生物进程、多生物过程、繁殖过程、节律过程、代谢过程、对刺激的反应、生物调节以及生长等途径。结论：TOP2A在ccRCC中高表达，并与其发生发展以及不良预后相关，因此TOP2A可能成为ccRCC的新型治疗靶点及预后标志物。

关键词

肾透明细胞癌，TOP2A，数据库，生物信息学

Expression and Clinical Significance of TOP2A in Clear Renal Cell Carcinoma Based on Bioinformatics Database

Shizhang Song, Wenxuan Li, Guinan Yang, Bo Jiang, Bowen Weng, Sichuan Hou^*

Department of Urology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University, Qingdao Shandong

Received: Sep. 13^th, 2021; accepted: Oct. 6^th, 2021; published: Oct. 15^th, 2021

ABSTRACT

Objective: To explore the expression and clinical significance of Topoisomerase IIA (TOP2A) in clear renal cell carcinoma (ccRCC). Methods: The mRNA and protein expression of TOP2A in ccRCC tissues were detected using databases including GEPIA, UALCAN and Human protein atlas (HPA). UALCAN database was applied to analyze the correlation between TOP2A mRNA and clinicopathological characteristics of ccRCC patients. The relationship between TOP2A expression and prognosis of ccRCC was analyzed with GEPIA, Kaplan-Meier and UALCAN. TIMER database was used to investigate correlations between TOP2A expression and various types of immune cell infiltration in ccRCC. Additionally, STRING and Metascape databases were used to construct a functional protein interaction network of TOP2A and investigate its functional mechanism. Results: TOP2A expression level in ccRCC tissues was significantly higher than in normal renal tissues (P < 0.05), and TOP2A mRNA expression level was positively correlated with the histological grade, clinical stage and N stage of ccRCC. Survival analysis showed that the overall survival rate of patients with low TOP2A expression was significantly higher than that of patients with high TOP2A expression (P < 0.05). TIMER database shows that the TOP2A expression had a positive correlation with infiltrating levels of B cells (r = 0.356, P < 0.01), CD4⁺ T cells (r = 0.232, P < 0.01), CD8⁺ T cells (r = 0.285, P < 0.01), macrophages (r = 0.304, P < 0.01), neutrophils (r = 0.43, P < 0.01) and dendritic cells (r = 0.466, P < 0.01) in ccRCC. In addition, the TOP2A protein interaction network was constructed through the STRING database and enrichment analysis indicated that TOP2A and its related genes were mainly involved in cellular process, regulation of biological process, positive regulation of biological process, negative regulation of biological process, multi-organism process, reproductive process, rhythmic process, metabolic process, response to stimulus, biological regulation, and growth. Conclusion: TOP2A is up-expressed in ccRCC and related to its occurrence, development and poor prognosis, which is expected to become a new therapeutic target and prognostic marker for ccRCC.

Keywords:Clear Cell Renal Cell Carcinoma, Topoisomerase IIA, Database, Bioinformatics

Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 前言

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是常见的泌尿系恶性肿瘤之一，大约占成人恶性肿瘤的2%~3%，其中肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是最常见的一种病理类型，约占全部RCC的75% [1] [2] [3]。目前据统计显示，ccRCC的发病率正在逐年升高 [4]。ccRCC早期临床表现不明显，据统计，ccRCC患者有六分之一在确诊的同时发现转移，而转移的ccRCC对传统的放化疗不敏感，故缺乏有效的治疗方法 [1]。目前尽管免疫治疗和靶向治疗取得一些进展，但是ccRCC转移及复发患者的预后仍不理想。因此寻找新型治疗靶点及分子标志物仍是当前研究的关键。

拓扑异构酶2A (Topoisomerase IIA, TOP2A)是一种基因编码DNA拓扑异构酶IIα，对应的编码基因是TOP2A基因，其位于17号染色体(17q21-q22)上，可以编码一个170 kDa的DNA拓扑异构酶IIα [5]。TOP2A主要作用是参与各种细胞生物过程，如DNA复制、重组、转录，染色质的浓缩、分离以及染色体的结构维护等 [6] [7]。并且，TOP2A是一种细胞周期依赖性蛋白，其表达高度依赖于细胞的增殖，当细胞增殖或分裂停止时可被抑制 [8]。不少研究发现，TOP2A在多种不同恶性肿瘤如肺癌、肝癌、乳腺癌、肠癌等中都具有高表达，而且其表达水平与肿瘤的发生和发展密切相关 [9] [10] [11] [12] [13]。目前关于TOP2A与ccRCC的相关研究和报道较少，为积极探寻ccRCC新型治疗靶点及高灵敏度分子标志物，本研究利用现有的各种肿瘤生物信息数据库，通过生物信息学方法探讨TOP2A在ccRCC中的表达、预后以及作用机制，为ccRCC的靶向治疗以及预后发生分子机制提供一定的理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 应用GEPIA与UALCAN数据库分析TOP2A基因的表达水平

GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)是由北京大学研制开发的可用于在线分析的数据库。主要用于分析肿瘤和正常样本的RNA表达差异、肿瘤不同时期中RNA表达差异以及生存曲线分析 [14]。本研究利用此数据库的默认参数分析了TOP2A在ccRCC患者和正常患者中的表达情况。UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一个分析肿瘤转录组数据的网站，收录来自31种类型肿瘤的RNA-seq和临床数据，可以分析某个基因在正常组织和肿瘤组织中的表达情况并进行生存分析 [15]。本研究利用此数据分析了TCGA数据库中TOP2A在正常肾组织与ccRCC组织中的表达情况。

2.2. 应用人类蛋白质表达图谱(Human Protein Atlas, HPA)数据库分析TOP2A的表达

HPA数据库(https://www.proteinatlas.org/)是是一个基于免疫组化抗体分析和RNA测序分析的大型转录组和蛋白组数据库，其包含了所有24,000个人类蛋白的组织和细胞分布信息，并可以提供至少576张免疫组化染色图片，供专业人员进行检查和索引 [16]。也可用于分析正常组织及肿瘤组织的蛋白质表达差异。本研究利用此数据库中的TOP2A组化抗体(HPA026773)对正常肾组织和ccRCC组织进行免疫组化实验，从蛋白水平分析TOP2A在正常肾组织和ccRCC组织中的表达。

2.3. 利用UALCAN分析TOP2A的表达和临床病理特征、预后的关系

进入UALCAN数据库，通过设置条件1) gene：TOP2A；2) TCGA dataset: Kidney renal clear cell carcinoma。获得TOP2A基因在不同性别、年龄、病理分期、临床分期以及种族等临床病理特征中的表达情况。并分析ccRCC组织中TOP2A与患者预后的关系。

2.4. 利用Kaplan-Meier Plotter、GEPIA数据库分析TOP2A与ccRCC的预后关系

Kaplan-Meier数据库(http://kmplot.com/analysis/)可用于分析多种癌症的mRNA表达情况及预后。其包含18764份癌症样本，以供于评估54,675个基因对患者生存率的影响 [17]。本研究利用Kaplan-Meier Plotter分析了ccRCC患者的总生存率(overall survival, OS)与TOP2A表达的相关性。以及利用GEPIA中的Survival Analysis分析TOP2A的表达与ccRCC患者的预后相关性。

2.5. 通过TIMER数据库中的基因模块分析TOP2A表达与ccRCC免疫细胞浸润的关系

TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是评估各种癌症类型免疫浸润的综合数据库，其涵盖了TCGA中的32种肿瘤，共计10,897个样本 [18]。本研究利用该数据库的基因模块分析了ccRCC中TOP2A表达与免疫细胞浸润水平的相关性，其中免疫细胞包括B细胞、CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

2.6. 通过STRING数据库进行蛋白质–蛋白质相互作用 (Protein-Protein Interaction, PPI)网络的构建

STRING数据库(https://string-db.org)是将已知蛋白和预测蛋白之间相互作用的数据组成的数据库，包括直接和间接的相互作用 [19]。本研究通过使用该数据库分析与TOP2A相互作用的蛋白并构建PPI网络，设置条件：1) Protein Name：TOP2A；2) Organism: Homo sapiens；3) Minimum required interaction score：medium confidence (0.400)；4) Max number of interactors: no more than 10 interactors。

2.7. 利用Metascape对TOP2A及其关联基因进行富集功能分析

Metascape网站(http://metascape.org)是一个基于Web的门户，旨在为实验生物学家提供全面的基因列表注释和分析资源 [20]。通过在GEPIA网站分析TOP2A基因的关联表达基因的相关性并利用Metascape对TOP2A及其关联基因进行富集功能分析，以探讨在ccRCC发生发展中的潜在作用机制。

3. 结果

3.1. TOP2A在正常肾组织和ccRCC组织中的表达差异

利用UALCAN对533例ccRCC患者的TOP2A mRNA表达进行了生物信息学分析。结果显示，与匹配的正常肾组织相比，ccRCC组织中TOP2A mRNA的表达显著增加(P < 0.05) (图1(a))。在GEPIA数据库中检测到100例正常肾组织和523例ccRCC肿瘤标本中TOP2AmRNA的表达。结果同样表明，与正常肾组织相比，ccRCC中的TOP2A的表达明显升高(P < 0.05) (图1(b))。采用HPA数据库中的TOP2A免疫组织化学抗体(HPA026773)进行免疫组织化学分析TOP2A在正常肾组织和ccRCC组织中的蛋白表达，结果发现在正常肾组织的肾小球细胞中未被检测出，在肾小管细胞中着色弱，未检测出(图2(a))；在ccRCC组织中，抗体染色程度呈高水平(图2(b))。

图1. TOP2A mRNA在ccRCC组织和正常肾组织中的表达。(a) 来自UALCAN数据库；(b) 来自GEPIA数据库

图2. TOP2A蛋白在正常肾组织和ccRCC组织中的表达(免疫组化染色)

3.2. TOP2A的表达与ccRCC临床病理的相关

通过UALCAN数据库分析了TOP2A mRNA与ccRCC病理特征的关联，发现TOP2A与性别、年龄、病理分期、亚型、临床分期和淋巴结分期中存在差异表达，且差异具有统计学意义(P < 0.05) (图3)；而在性别分组间、年龄分组间相互进行对比，差异无统计学意义(P > 0.05)。并且随着病理分期、临床分期(图3(c)、图3(e))以及淋巴结转移分期(图3(f))的升高，TOP2A的表达水平呈上升趋势，这表明TOP2A的高表达可能与ccRCC进展有关。

图3. TOP2A mRNA的表达与ccRCC各个临床病理之间的关系。(a) TOP2A表达与性别的关系；(b) TOP2A表达与年龄的关系；(c) TOP2A表达与病理分期的关系；(d) TOP2A表达与亚型的关系；(e) TOP2A表达与临床分期的关系；(f) TOP2A表达与淋巴结分期的关系

3.3. TOP2A的表达与ccRCC预后的相关

通过Kaplan-Meier Plotter、GEPIA以及UALCAN数据库，分别分析了TOP2A mRNA表达水平对ccRCC患者的生存的影响，发现三个数据库的结果一致，TOP2A的表达与ccRCC患者的总体生存率相关(OS)相关，且与高表达TOP2A的ccRCC患者相比，低表达TOP2A的ccRCC患者的总体生存率(OS)更高(图4(a)~(c))，差异具有统计学意义(P < 0.05)。

图4. TOP2A mRNA表达水平与ccRCC患者生存的关系。(a) 来自 Kaplan-Meier数据库；(b) 来自GEPIA数据库；(c) 来自UALCAN数据库

3.4. TOP2A在ccRCC的表达与免疫细胞浸润的关系

通过TIMER数据库“Gene”模块，分析TOP2A表达量在ccRCC中免疫浸润水平的相关性，结果发现TOP2A的表达与细胞纯度呈负相关(r = −0.166, P < 0.01)，与B细胞(r = 0.356, P < 0.01)、CD4⁺ T细胞(r = 0.232, P < 0.01)、CD8⁺ T细胞(r = 0.285, P < 0.01)、巨噬细胞(r = 0.304, P < 0.01)、中性粒细胞(r = 0.43, P < 0.01)以及树突状细胞(r = 0.466, P < 0.01)的免疫浸润水平呈正相关，说明以上各项免疫细胞在ccRCC组织中越多，TOP2A的表达则越高，提示TOP2A可能参与ccRCC的免疫浸润过程(图5)。

图5. TOP2A表达与ccRCC免疫细胞浸润的关系

3.5. PPI网络的构建及TOP2A关联基因的富集分析

通过STRING数据库分析与TOP2A密切联系的基因，获得到一个包含11个节点、47种相互作用的PPI网络(P < 0.01)，其中与TOP2A相互作用的有(score > 0.900) TPX2、TOP1、CDK1、UBE2C、PBK、BUB1、NCAPG、DLGAP5、CCNB1、CCNB2 (图6(a))。通过GEPIA数据库的“Correlation”模块分析，TOP2A与上述PPI网络中相互作用的基因均呈正相关。其中CDK1与TOP2A的关系最为密切(Pearson系数 = 0.85，P < 0.001) (图6(b))。以及利用Metascape对TOP2A及其以上密切关联的基因进行GO功能富集分析，结果发现TOP2A及其相互作用的基因主要参与细胞代谢过程、正负向调节生物进程、多生物过程、繁殖过程、节律过程、代谢过程、对刺激的反应、生物调节以及生长等途径(图6(c))。

图6. TOP2A相关蛋白网络的构建及功能分析。(a) TOP2A相关的PPI网络；(b) TOP2A与其共表达基因CDK1的相关性；(c) TOP2A相关蛋白网络功能分析(GO富集)

4. 讨论

肾细胞癌(RCC)是一种致死性疾病，在世界范围内新发病例超过40万例，每年死亡人数超过175,000人 [4]。肾细胞癌(RCC)是最常见的肾癌类型，包括ccRCC、乳头状肾细胞癌和嫌色细胞癌等多种病理亚型，而ccRCC在肾细胞癌中约占居75% [3]。在早期诊断并采取肾切除术是针对ccRCC最有效的措施 [21]。然而，由于缺乏相关的生物标志物，导致对ccRCC的早期诊断有限。并且与早期诊断所带来的挑战是有六分之一的患者在诊断时出现远处转移性疾病 [1]。而转移的ccRCC对传统的放化疗不敏感，故缺乏有效的治疗方法。因此，寻找新型分子标志物为临床治疗ccRCC提供新思路至关重要。

TOP2A是一种关键的核酶，参与着DNA代谢过程中的复制、转录以及染色体分离等过程 [7]。TOP2A在增值细胞中的表达有着明显的周期特异性，在G1期低表达，S期时表达增加，到G2/M期是表达到达顶峰 [22]。当人类细胞中TOP2A蛋白表达被沉默时，细胞分裂停止，所以TOP2A被认为是正常组织中细胞增值的标志物，与非肿瘤细胞相比，TOP2A在癌细胞中具有明显高表达 [23]。既往研究表明，TOP2A高表达于多种肿瘤组织中，而且与肿瘤的分化、肿瘤的侵袭性以及生存预后密切相关 [8]。Zhang等 [13] 人发现TOP2A在结肠癌组织的表达明显高于癌旁组织，以及随着结肠癌肿瘤的分期的增加TOP2A的表达随之升高。Romero等 [24] 人发现TOP2A在不同乳腺癌亚型中都呈现高表达，但在高增值亚型乳腺癌中的TOP2A表达则更高。同样很多研究发现TOP2A的高表达与前列腺癌、胃癌以及甲状腺乳头状癌的不良预后有着密切关联 [25] [26] [27]。目前TOP2A在ccRCC中的研究报道较少，故本研究通过现有的各种肿瘤生物信息数据库，通过生物信息学方法探讨TOP2A在ccRCC组织中的表达并探讨其潜在的生物学机制，为更深入研究TOP2A在ccRCC中的作用机制提供理论帮助。

本研究首先通过GEPIA、UALCAN、The Human Protein Atlas以及Kaplan-Meier Plotter数据库分析，发现TOP2A在ccRCC组织中较正常肾组织呈高表达，以及分析TOP2A与ccRCC病理特征及ccRCC患者预后的关联，发现其表达水平与病理分期、临床分期以及淋巴结转移分期具有正相关性，说明TOP2A的表达与患者肿瘤的进展相关；三个数据库预后分析结果一致表明低表达TOP2A的ccRCC患者比高表达TOP2A的ccRCC患者的总体生存率(OS)更高，提示TOP2A与ccRCC患者的不良预后相关。以及通过TIMER数据库结果发现TOP2A的表达与B细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及树突状细胞的免疫浸润水平呈正相关，提示TOP2A可能参与ccRCC的免疫浸润过程。通过STEING数据库分析，结果发现TOP2A可能与TPX2、TOP1、CDK1、UBE2C、PBK、BUB1、NCAPG、DLGAP5、CCNB1、CCNB2等基因存在着相关作用，其中CDK1与TOP2A的关系最为密切，CDK1是细胞周期素依赖性激酶1，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白家族，其在人多能干细胞的多个事件中具有调节有丝分裂、维持G2/M检查点、细胞凋亡、细胞多能性和维持基因组稳定性的作用 [28]。Heo等 [29] 人研究表明CDK1介导的TFCP2L1磷酸化是干细胞多能性和膀胱癌细胞发生所必需的。Pan等 [30] 人研究表明，在肾癌细胞中，通过敲除EIF3D基因可以下调CyclinB1/CDK1通路从而导致G2/M期阻滞，最终抑制肾癌细胞的发生。上述已证明TOP2A与CDK1关系密切，并且TOP2A在细胞中G2/M期的表达最高，若抑制TOP2A的表达，是否同样可以抑制肾癌细胞的发生这一问题值得进一步研究。最后利用Metascape对TOP2A密切关联的基因进行GO功能富集分析发现，TOP2A与其密切相关基因可能参与细胞代谢过程、正负向调节生物进程、多生物过程、繁殖过程、节律过程、代谢过程、对刺激的反应、生物调节以及生长等途径，这些过程与肿瘤的发生和发展均有着密切关系。

5. 结论

综上所述，本研究通过数据库以及生物学信息方法分析，TOP2A在ccRCC的呈高表达，并与ccRCC的发生进展有着密切相关，以及与ccRCC患者的不良预后相关，有望成为ccRCC的新型治疗靶点及预后标志物。为深层次研究TOP2A在ccRCC中的作用机制提供线索和理论基础。但本研究仍有不足之处，本研究局限于数据库发掘的结果，属于探索性研究，之后仍需要通过临床体内外实验进一步开展来验证TOP2A在ccRCC中的具体作用机制。

文章引用

宋诗璋,李汶轩,杨桂楠,姜 波,翁博文,侯四川. 基于生物信息学数据库分析TOP2A在肾透明细胞癌中的表达及临床意义
Expression and Clinical Significance of TOP2A in Clear Renal Cell Carcinoma Based on Bioinformatics Database[J]. 临床医学进展, 2021, 11(10): 4470-4479. https://doi.org/10.12677/ACM.2021.1110655

参考文献