¹广西大学动物科学技术学院，广西水生动物病害诊断实验室，水生生物健康养殖与营养调控重点实验室，广西 南宁

²合浦县水产技术推广站，广西 北海

³港口区渔业技术推广站，广西 防城港

收稿日期：2023年2月16日；录用日期：2023年3月8日；发布日期：2023年3月22日

摘要

本实验通过PCR方法检测27株广西凡纳滨对虾源弧菌中整合子相关基因携带情况，为凡纳滨对虾弧菌病的综合防控提供指导。共采集溶藻弧菌7株，创伤弧菌10株，副溶血弧菌10株。PCR检测结果，27株弧菌中int1、sul1、qacEΔ1、int2和int3基因的检出率依次为63.0%、40.7%、48.1%、0%和0%。受试菌株共包含5种整合子相关基因型，即int1⁻sul1⁻qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻、int1⁺sul1⁻qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻、int1⁺sul1⁺qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻、int1⁺sul1⁺qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻和int1⁺sul1⁻qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻，其中优势基因型为int1⁻sul1⁻qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻和int1⁺sul1⁺qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻，各占37.0% (10/27)。在溶藻弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌的检出率：int1基因分别为28.6% (2/7)、90.0% (9/10)和60.0% (6/10)；sul1基因分别为0% (0/7)、90.0% (9/10)和20.0% (2/10)；qacEΔ1基因分别为14.3% (1/7)、90.0% (9/10)和30.0% (3/10)。int1、sul1和qacEΔ1基因在三种弧菌之间的检出率差异显著(P<0.05)，在创伤弧菌中的检出率最高，在溶藻弧菌中的检出率最低。

关键词

凡纳滨对虾，弧菌，整合子，检测

Detection of Integron Related Genes in Vibrios from Litopenaeus vannamei in Guangxi

Zupeng Yang¹, Wenyu Tan¹, Zhigang Wu¹, Hua Wei¹, Hongyao Zhang¹, Desheng Huang², Zhenhao Zhang³, Jingzhen Liang^1*

¹Key Laboratory of Aquatic Healthy Breeding and Nutrition Regulation, Guangxi Aquatic Animal Disease Diagnostic Laboratory, Institute of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning Guangxi

²Hepu Station of Aquaculture Technology Extension, Beihai Guangxi

³Gangkou Station of Fishery Technology Extension, Fangchenggang Guangxi

Received: Feb. 16^th, 2023; accepted: Mar. 8^th, 2023; published: Mar. 22^nd, 2023

ABSTRACT

In this experiment, the carrying status of integron related genes in 27 isolates of Vibrio sp. from Litopenaeus vannamei of Guangxi was detected by PCR method, so as to provide direction for comprehensive prevention and control of Vibrio disease in L. vannamei. There were 7 isolates of V. alginolyticus, 10 isolates of V. vulnificus and V. parahaemolyticus samples. PCR detection results showed that among the 27 isolates of Vibriosp, the positive rates of int1, sul1, qacEΔ1, int2 and int3 genes were 63.0%, 40.7%, 48.1%, 0% and 0%, respectively. There were 5 kinds of integron related genotypes containing int1⁻sul1⁻qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻, int1⁺sul1⁻qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻, int1⁺sul1⁺ qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻, int1⁺sul1⁺qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻ and int1⁺sul1⁻qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻, in which int1⁻sul1⁻ qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻ and int1⁺sul1⁺qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻are the dominant genotypes, each accounting for 37.0% (10/27). The positive rates in V. alginolyticus, V. vulnificus and V. parahaemolyticus were 28.6% (2/7), 90.0% (9/10) and 60.0% (6/10) of int1 gene, 0% (0/7), 90.0% (9/10) and 20.0% (2/10) of sul1 gene, 14.3% (1/7), 90.0% (9/10) and 30.0% (3/10) of qacEΔ1. The positive rates of int1, sul1 and qacEΔ1 genes were significantly different among the three kinds of Vibrio sp. (P < 0.05). The highest positive rates were observed in V. vulnificus isolates and the lowest ones were in V. alginolyticus isolates.

Keywords:Litopenaeus vannamei, Vibrio, Integron, Detection

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1. 引言

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有耐高温、耐低盐、生长快、抗病力强、肉质鲜美、适合高密度养殖、对营养需求较低等优点，经济和商业价值均较高，其养殖业已成为广西水产养殖的支柱产业之一 [1] 。弧菌作为海水环境中最常见的条件致病菌，对规模化对虾养殖的危害非常严重，容易引起烂尾病、烂鳃病、红腿病、肠炎、肝胰腺坏死等疾病 [2] 。这些对虾弧菌病在世界范围内分布广泛 [3] ，无特定感染品种，在对虾育苗、养成、越冬等阶段均会发生，当水温为25~32℃时为弧菌病发病高峰期 [4] 。近年，弧菌病严重影响了广西凡纳滨对虾养殖业的健康发展。弧菌病常用治疗措施为使用抗生素或消毒剂 [5] ，而抗生素滥用可诱导细菌产生耐药 [6] 。细菌耐药会引起水产养殖的经济损失，多重耐药菌株的出现更是使治疗面临巨大挑战，目前已有不少关于广西凡纳滨对虾源弧菌多重耐药性的报道 [7] 。细菌多重耐药的产生与移动性遗传元件(如整合子、质粒、转座子等)密切相关 [8] 。整合子是一种能利用位点特异性重组系统在不同细菌中传播的可移动基因元件，具有捕获、整合、表达外源耐药基因盒的功能，有507种抗生素抗性基因可作为整合子基因盒被整合子所捕获 [9] [10] [11] 。根据整合酶的不同可分为I、II和III型整合子，I型整合子基因结构通常包含5'端I型整合酶基因int1、3'端可能含有季铵盐耐药基因qacEΔ1和磺胺类耐药基因sul1；II型整合子主要位于转座子Tn7及其衍生物上，II型整合酶int2与int1有46%的同源性 [12] ；III型整合子的相关报道较少，III型整合酶int3与int1有60.9%的同源性 [12] 。不同细菌的整合子基因含量在一定程度上反映当地的抗生素使用情况，以及细菌的耐药状况，目前广西虾源弧菌整合子相关基因检测主要集中于副溶血弧菌，有关其他种类弧菌整合子的报道较少。本实验对27株广西凡纳滨对虾源弧菌(包括溶藻弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌)进行整合子相关基因int1、sul1、qacEΔ1、int2、int3的检测和分析，其结果可为广西凡纳滨对虾弧菌病的综合防控提供指导、为多重耐药弧菌发生和传播的预防提供理论依据。

2. 实验材料与方法

2.1. 实验材料

试验菌株为本实验室于2021年从广西沿海患病凡纳滨对虾中分离的27株弧菌，其中溶藻弧菌7株、创伤弧菌10株、副溶血弧菌10株，菌株信息见表1。在试验前均已再次进行API生理生化鉴定和16S rRNA分子生物学鉴定。细菌基因组DNA提取试剂盒和PCR反应酶2× Taq MasterMix均购自北京艾德莱生物科技有限公司。

表1. 27株弧菌菌株信息

2.2. 细菌DNA的提取及整合子相关基因PCR检测

参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书来提取细菌总DNA。整合子相关基因int1、sul1、qacEΔ1、int2和int3的PCR扩增引物根据姚小娟 [6] 的方法进行设计并由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成(表2)。25 µL的PCR反应体系为：DNA模板1 µL，上、下游引物各1 µL，2× Taq Master Mix 12.5 µL，灭菌去离子水9.5 µL。PCR反应程序设置为94℃预变性5 min；94℃ 40 s，退火30 s (退火温度见表2)，72℃延伸90 s，35个循环；72℃充分延伸10 min。以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，在北京六一凝胶成像系统观察电泳结果。将符合预计片段长度的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

未扩增出预期片段大小的菌株，退火温度以表2所示温度为中心温度，±5℃再做梯度PCR并调试其他扩增条件，反复试验仍无预期大小片段出现者视为该基因检测结果为阴性。

表2. PCR反应引物序列、退火温度及预计产物长度

2.3. 序列分析

以DNAStar的Megalign软件计算整合子相关基因序列的同源性。采用ClustalX进行序列完全比对分析后采用Mega5软件的邻接法构建进化树，Bootstrap重复1000次检验其可信度。

2.4. 统计分析

使用SPSS18.0软件的χ²检验分析在溶藻弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌之间整合子相关基因检出率的差异性，当P < 0.05时表示差异显著。

3. 实验结果

3.1. 整合子相关基因的PCR检测结果

对27株弧菌进行整合子相关基因int1、sul1、qacEΔ1、int2和int3的PCR检测，结果表明部分受试菌株可扩增出大小约为890 bp的int1基因片段、779 bp的sul1基因片段和226 bp的qacEΔ1基因片段(图1)，与预计片段长度一致。将阳性PCR产物送测序，其测序结果经比对确认这些产物片段均为int1、sul1、qacEΔ1基因的序列片段。经反复PCR检测，27株弧菌均未扩增出int2和int3基因片段。

图1. int1、sul1和qacEΔ1基因PCR扩增结果

根据PCR检测结果，27株弧菌菌株的整合子相关基因int1、sul1、qacEΔ1、int2和int3的检出率分别为63.0% (17/27)、40.7% (11/27)、48.1% (13/27)、0% (0/27)和0% (0/27)。共包含5种整合子相关基因型，即int1⁻sul1⁻qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻、int1⁺sul1⁻qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻、int1⁺sul1⁺qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻、int1⁺sul1⁺qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻和int1⁺sul1⁻qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻，分布率依次为37.0% (10/27)、11.1% (3/27)、3.7% (1/27)、37.0% (10/27)和11.1% (3/27) (表3)。

表3. 弧菌菌株整合子相关基因的检测结果

3.2. 整合子相关基因的序列分析

基于890 bp的int1基因构建的进化树如图2所示，可见创伤弧菌CS02、副溶血弧菌FR04和溶藻弧菌RZ03的int1基因序列与中国人源的霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei) CP098781.1、大肠杆菌(Escherichia coli) CP101198.1、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi) JF731030.1、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica) CP100745.1聚为一支，在进化关系上比较近；与日本人源绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) LC685027.1、中国污水源葡萄牙柠檬酸杆菌(Citrobacter portucalensis) CP089439.1、美国人源肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) CP098357.1在进化关系上距离较远。基于890 bp的int1基因序列，与CP098781.1、CP101198.1、JF731030.1、CP100745.1、LC685027.1、CP089439.1、CP098357.1的同源性：CS02分别为99.8%、99.8%、99.4%、99.6%、42.8%、39.2%、38.9%；FR04分别为97.5%、97.7%、97.8%、97.7%、43.4%、40.1%、39.9%；RZ03分别为67.3%、67.7%、67.8%、67.1%、39.1%、34.0%、34.0%。

图2. 基于int1基因序列构建的进化树

基于779 bp的sul1基因序列构建的进化树如图3所示，可见副溶血弧菌FR05和创伤弧菌CS02的sul1基因序列与新加坡人源大肠杆菌CP102062.1、中国人源奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) CP098444.1、韩国犬源肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) CP098127.1、泰国犬源肺炎克雷伯菌CP101878.1、中国虾源溶藻弧菌OK067239.1聚为一支，在进化关系上比较近；与日本人源绿脓杆菌LC685027.1、日本人源霍氏肠杆菌AP025852.1、英国人源宋内志贺氏菌(Shigella sonnei) CP102116.1在进化关系上距离较远。基于779 bp的sul1基因序列，与大肠杆菌CP102062.1、奇异变形杆菌CP098444.1、肺炎克雷伯菌CP098127.1、肺炎克雷伯菌CP101878.1、溶藻弧菌OK067239.1、绿脓杆菌LC685027.1、霍氏肠杆菌AP025852.1、宋内志贺氏菌CP102116.1的同源性：FR05分别为99.5%、99.3%、98.3%、98.4%、98.4%、45.6%、45.2%、44.5%；CS02分别为93.0%、92.9%、98.2%、98.4%、98.4%、45.2%、44.2%、44.2%。

基于226 bp的qacEΔ1基因构建的进化树如图4所示，可见创伤弧菌CS02、副溶血弧菌FR03和溶藻弧菌RZ03的qacEΔ1基因序列与瑞士牛源化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes) CP097247.1、中国食源阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii) CP080592.1、英国人源霍乱弧菌(Vibrio cholerae) OW443151.1、中国人源肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica) CP101341.1聚为一支，在进化关系上相对较近；与西班牙污水源解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica) CP104455.1、美国人源鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii) CP104351.1、中国人源肺炎克雷伯菌CP104198.1在进化关系上相对较远。基于226 bp的qacEΔ1基因序列，与CP097247.1、CP080592.1、OW443151.1、CP101341.1、CP104455.1、CP104351.1、CP104198.1的同源性：FR03分别为100.0%、98.5%、100.0%、99.5%、46.4%、46.4%、46.4%；CS02分别为100.0%、100.0%、100.0%、99.5%、46.4%、46.4%、46.4%；RZ03分别为98.9%、98.9%、98.9%、97.3%、46.3%、46.3%、46.3%。

图3. 基于sul1基因序列构建的进化树

图4. 基于qacEΔ1基因序列构建的进化树

3.3. 整合子相关基因在三种弧菌的检出率

在溶藻弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌的检出率：int1基因分别为28.6% (2/7)、90.0% (9/10)和60.0% (6/10)；sul1基因分别为0% (0/7)、90.0% (9/10)和20.0% (2/10)；qacEΔ1基因分别为14.3% (1/7)、90.0% (9/10)和30.0% (3/10)。χ²检验分析结果，int1、sul1和qacEΔ1基因在三种弧菌之间的检出率差异显著(P < 0.05)，在创伤弧菌中的检出率最高，在溶藻弧菌中的检出率最低(见表4)。

表4. 三种弧菌之间整合子相关基因检出率比较

注：括号内的数值为携带整合子相关基因的菌株数与受试菌株数之比。

4. 讨论

弧菌是海水养殖环境中最常见的一类条件致病菌，广泛分布于海洋环境以及海洋生物体表和肠道中 [13] 。随着海水养殖规模化和集约化的发展，水产养殖动物的弧菌病频繁发生 [14] 。由于大多数弧菌也是人类临床致病菌，水产养殖源弧菌不可避免地引起食品安全问题 [15] 。抗生素目前被认为是治疗水产养殖动物弧菌病的有效手段，但由于养殖户使用抗生素方法不科学或水体污染等原因，许多地区的弧菌存在耐药甚至多重耐药现象，如2014年~2018年广西凡纳滨对虾分离的副溶血弧菌，超过90.0%以上的菌株为五重以上耐药菌株，2018年八重和九重耐药菌株数量合计占当年菌株总数的55.6% [7] 。细菌耐药性和整合子的密切联系让人们不得不重视整合子相关基因检测，针对不同弧菌的整合子相关基因检测对于弧菌的耐药防控具有重要意义 [16] 。

int1基因的进化树分析表明，创伤弧菌CS02和副溶血弧菌FR04的int1基因序列与中国人源霍氏肠杆菌CP098781.1、大肠埃希氏菌CP101198.1、贝氏不动杆菌JF731030.1、肠炎沙门氏菌CP100745.1的int1基因相似性较高，同源性在97.5%~99.8%，推测可能有共同的起源；溶藻弧菌RZ03与以上菌株的int1基因同源性约为67.1%~67.8%，可能与其在传播过程中发生了较大变异有关。副溶血弧菌FR05和创伤弧菌CS02的sul1基因与新加坡人源大肠埃希氏菌CP102062.1、中国人源奇异变形杆菌CP098444.1、韩国犬源肺炎克雷伯菌CP098127.1、泰国犬源肺炎克雷伯菌CP101878.1、中国虾源溶藻弧菌OK067239.1的sul1基因可能有共同的起源，同源性在92.9%~99.5%。创伤弧菌CS02、副溶血弧菌FR03和溶藻弧菌RZ03的qacEΔ1基因与瑞士牛源化脓隐秘杆菌CP097247.1、中国食源阪崎肠杆菌CP080592.1、英国人源霍乱弧菌OW443151.1、中国人源肠炎沙门氏菌CP101341.1的qacEΔ1基因也可能具有共同的起源，同源性在97.3%~100.0%。本实验结果表明整合子相关基因int1、sul1和qacEΔ1基因可能具有在不同地区、不同宿主或不同种属菌株之间进行广泛传播的能力。凡纳滨对虾养殖水环境很容易被整合子阳性的细菌所污染，而且水环境又为细菌提供了一个良好的耐药基因交流环境。建议加强凡纳滨对虾源弧菌的整合子相关基因检测，预防耐药或多重耐药弧菌的产生 [17] 。

广西凡纳滨对虾源弧菌中Ⅰ型整合子相关基因int1、sul1和qacEΔ1的总检出率分别为63.0%、40.7%、48.1%，三种基因的检出率在溶藻弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌菌株之间的差异均显著(P < 0.05)。与其它水产养殖源弧菌相比，本实验受试菌株的int1检出率与贺晓晨的凡纳滨对虾源副溶血弧菌 [7] (64.4%)、闫爽的狐源大肠杆菌 [18] (63.64%)的检出率接近，sul1检出率比孙起荣的猪源大肠杆菌 [19] (24.08)、贺晓晨的凡纳滨对虾源副溶血弧菌 [7] (25%)、刘旭的海水养殖弧菌 [20] (12.2%)的研究结果高，qacEΔ1检出率比贺晓晨的凡纳滨对虾源副溶血弧菌 [7] (27.9%)的研究结果高。可见，不同来源的菌株之间sul1和qacEΔ1检出率差异性相对较大，造成该结果的原因可能与菌株所处的水环境中含qacEΔ1和sul1基因的浓度不同有关。本实验中创伤弧菌的整合子相关基因检出率显著差异高于另两种弧菌，推测可能与不同养殖区域中弧菌分布的差异以及整合子相关基因丰度的差异有关。目前，对虾养殖用水存在被含有整合子阳性的生活、医疗或畜禽养殖废水污染的可能性，为尽可能控制广西凡纳滨对虾源弧菌多重耐药状况的加剧，建议应继续对整合子相关基因进行监控，同时有效处理生活、医疗或畜禽养殖废水，减少整合子相关基因的水平传播。

5. 结论

27株广西凡纳滨对虾源弧菌中，int1、sul1、qacEΔ1、int2和int3基因的检出率依次为63.0%、40.7%、48.1%、0%和0%；共包含5种整合子相关基因型，优势基因型为int1⁻sul1⁻qacEΔ1⁻int2⁻int3⁻和int1⁺sul1⁺qacEΔ1⁺int2⁻int3⁻。int1、sul1和qacEΔ1基因在创伤弧菌中的检出率最高，在溶藻弧菌中的检出率最低。

基金项目

国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设专项(nycytxgxcxtd-14-02)。

文章引用

杨祖鹏,谭雯予,吴志刚,魏 华,张洪耀,黄德生,张振豪,梁静真. 广西凡纳滨对虾源弧菌整合子相关基因检测
Detection of Integron Related Genes in Vibrios from Litopenaeus vannamei in Guangxi[J]. 水产研究, 2023, 10(01): 13-22. https://doi.org/10.12677/OJFR.2023.101002

参考文献