福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州

收稿日期：2023年8月24日；录用日期：2023年9月17日；发布日期：2023年9月26日

摘要

目的：观察肾气虚型哮喘大鼠的一般状态情况、哮喘症状评分与炎症因子IL-6、IL-17、IL-10、IL-35之间的关系，并予全真一气汤干预，探讨评估肾气虚型哮喘大鼠气道炎症的指标。方法：将24只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、低剂量治疗组(8.33 g/kg)和高剂量治疗组(33.32 g/kg)，每组6只。模型组与低、高剂量治疗组予卵蛋白1 mg、氢氧化铝凝胶10 mg的混悬液1 mL致敏，1%的卵清蛋白超声雾化吸入以激发哮喘，进行惊恐刺激，负重游泳直至力竭等进行肾气虚型哮喘大鼠造模，造模成功后开始药物干预。空白组和模型组予生理盐水3 mL灌服，治疗组按低、高剂量予全真一气汤3 mL灌服，每日1次，连服30天。观察并记录大鼠雾化刺激时的一般状态及行为表现，酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测血清IL-6、IL-17、IL-10、IL-35细胞因子含量。结果：与空白组相比，模型组和全真一气汤低、高剂量组大鼠均出现腹式呼吸、呼吸急促、搔鼻、口唇发绀等症状，并伴有毛色暗沉无光泽，蜷缩嗜卧，腹肌痉挛，饮食减少，排便增多等行为状态改变，哮喘症状评分显著升高(P < 0.05)；模型组血清IL-6、IL-17含量明显增加(P < 0.05)，血清IL-10、IL-35的含量明显减少(P < 0.05)；与模型组相比，全真一气汤低、高剂量组的哮喘症状评分显著降低(P < 0.05)，全真一气汤低剂量组、高剂量组血清IL-6、IL-17的含量明显减少(P < 0.05)，IL-35的含量明显增加(P < 0.05)；与全真一气汤低剂量组相比，血清IL-6的含量减少(P < 0.05)，IL-35的含量明显增加(P < 0.05)。结论：肾气虚型哮喘大鼠一般状态情况越差，哮喘症状评分越高，促炎因子IL-6、IL-17的含量越高，抗炎因子IL-35、IL-10的含量越低。

关键词

肾气虚型，支气管哮喘，气道炎症，炎症因子

Study on Airway Inflammation Index in Asthmatic Rats with Kidney-Qi Deficiency

Jing Zhang^*, Xiaochen Wu, Jiawang Zhang, Yujie Xie

Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou Fujian

Received: Aug. 24^th, 2023; accepted: Sep. 17^th, 2023; published: Sep. 26^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To observe the general state of asthma rats with kidney-qi deficiency, the relationship between asthma symptom score and inflammatory factors IL-6, IL-17, IL-10 and IL-35, and to intervene with Quanzhen Yiqi Decoction to explore the indexes for evaluating airway inflammation in asthma rats with kidney-qi deficiency. Methods: Twenty-four SD male rats were randomly divided into blank group, model group, low-dose treatment group (8.33 g/kg) and high-dose treatment group (33.32 g/kg), with 6 rats in each group. The model group and the low-dose and high-dose treatment groups were sensitized with 1 mL of suspension of ovalbumin 1 mg and aluminum hydroxide gel 10 mg, and 1% ovalbumin was inhaled by ultrasonic atomization to stimulate asthma, and the rats were stimulated by panic, swimming with load until exhaustion, etc., and drug intervention was started after the model was successfully established. The blank group and model group were given 3 mL of normal saline, while the treatment group was given 3 mL of Quanzhen Yiqi Decoction at low and high doses, once a day for 30 days. Observe and record the general state and behavior of rats when they are stimulated by atomization, and detect the contents of IL-6, IL-17, IL-10 and IL-35 cytokines in serum by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results: Compared with the blank group, the rats in the model group and the low and high dose groups of Quanzhen Yiqi Decoction all showed symptoms such as abdominal breathing, shortness of breath, scratching nose, cyanosis of mouth and lips, accompanied by behavioral changes such as dull fur, crouching, abdominal muscle spasm, decreased diet and increased defecation, and the asthma symptom score increased significantly (P < 0.05). The contents of serum IL-6 and IL-17 in model group increased significantly (P < 0.05), while the contents of serum IL-10 and IL-35 decreased significantly (P < 0.05). Compared with the model group, the scores of asthma symptoms in low and high doses of Quanzhen Yiqi Decoction were significantly decreased (P < 0.05), and the contents of serum IL-6 and IL-17 in low and high doses of Quanzhen Yiqi Decoction were significantly decreased (P < 0.05), while the content of IL-35 was significantly increased (P < 0.05). Compared with the low-dose group of Quanzhen Yiqi Decoction, the content of serum IL-6 decreased (P < 0.05) and the content of IL-35 increased significantly (P < 0.05). Conclusion: The worse the general state of asthma rats with kidney-qi deficiency, the higher the asthma symptom score, the higher the contents of pro-inflammatory factors IL-6 and IL-17, and the lower the contents of anti-inflammatory factors IL-35 and IL-10.

Keywords:Kidney-Qi Deficiency, Bronchial Asthma, Airway Inflammation, Inflammatory Factor

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

支气管哮喘是一种嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞及T淋巴细胞等炎性细胞活化过度介导的慢性气道炎症性疾病。最新研究表明Th17细胞及其表达的相关炎性细胞因子如IL-6、IL-17在哮喘患者的外周血及痰培养中较健康对照组均有所增加，且随着气道阻力升高而上调 [1] [2] [3] 。而IL-10、IL-35等由Treg细胞表达相关细胞因子与哮喘严重程度呈负相关性 [4] 。本实验通过观察肾气虚型哮喘大鼠的一般状态情况、哮喘症状评分与炎症因子IL-6、IL-17、IL-10、IL-35之间的关系，探讨评估肾气虚型哮喘大鼠气道炎症的指标。

2. 材料

2.1. 实验动物

SPF级雄性SD大鼠24只，体质量为(200 ± 5) g，购自杭州医学院动物实验中心，许可证号码：SCXK(浙)2019-0002。

2.2. 干预药物

全真一气汤(熟地黄15 g，麦冬15 g，淡附子6 g，生晒参15 g，白术6 g，牛膝15 g，五味子6 g)按体重换算为大鼠剂量，于福建中医药大学附属第二人民医院中药房加工成生药含量0.5 g/mL的溶液，封存备用。

2.3. 主要试剂

卵清蛋白(美仑生物技术有限公司，批号：M0228A)、氢氧化铝凝胶(美仑生物技术有限公司，批号：O1004A)、大鼠IL-6、IL-17、IL-35、IL-10 ELISA试剂盒(酶免生物，批号：MM0190R2、MM-0088R2、MM-0856R2、MM-0195R2)。

2.4. 实验仪器

医用压缩空气式雾化器(上海海尔医疗科技有限公司，型号：YS-06)，微量冷冻离心机(贝克曼，型号：Microfuge-22R)，移液器(德国eppendorf公司)，酶标仪(美国伯乐公司)。

2.5. 伦理审查

实验中对实验大鼠的处理通过福建中医药大学附属第二人民医院动物伦理委员会批准，批件编号：FJPSPH-IAEC2020111。

3. 方法

3.1. 动物模型制备与分组

将大鼠安置于福州市仓山区瑞科医药健康产业园2座动物实验中心，随机分为空白组、肾气虚型哮喘模型组和全真一气汤低剂量治疗组、高剂量治疗组，每组6只大鼠，以专用饲料和饮用水喂养7天。依据孟鹏飞等 [5] [6] [7] 的报道进行哮喘模型的制备：除空白组外，各组大鼠实验第一天腹腔注射含有卵蛋白1 mg、氢氧化铝凝胶10 mg的混悬液1 mL致敏，第8天同法再次致敏。第15日起将致敏后大鼠安置于适宜大小的玻璃罩中，每日给予1%的卵清蛋白超声雾化吸入1次以激发哮喘，连续激发直至处死。同时参照郑小伟等 [8] 的方法进行肾气虚型模型的制备：实验第一天开始，在安静环境中对模型组及高低剂量组大鼠进行惊恐刺激，即播放猫叫声磁带(10 min/次)、梅花针叩刺模拟猫抓鼠情景(20次/min)，再将其置于水槽中(水深50 cm、水温20℃)负重游泳直至力竭，以大鼠鼻尖没入水面10 s为度，日1次，共14天。大鼠呼吸频促，口唇发绀，纳食减少，体重增幅不显或反降，毛枯色黯，或伴烦躁不安，搔抓耳鼻，嗜睡蜷卧，活动迟缓等，听诊肺部可闻及哮鸣音，提示造模成功，可纳入研究。

3.2. 药物干预

取出生药含量0.5 g/mL的全真一气汤(生晒参15 g，麦冬15 g，熟地黄15 g，淡附子6 g，白术6 g，牛膝15 g，五味子6 g)备用。中药组每次给药前用电子秤称重，记录每只大鼠体重，并按体重和剂量标准(低剂量治疗组：8.33 g/kg、高剂量治疗组：33.32 g/kg，相当于临床剂量的0.5倍、2倍)换算成相应服药浓度，然后进行生理盐水稀释。高低剂量组每日予全真一气汤3 mL灌胃，正常组与模型组每日予生理盐水3 mL灌服，共30天。

3.3. 血标本采集

第34天开始取材，用乌拉坦腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧置于托盘中进行解剖，暴露胸腹，找到腹主动脉采血10 mL。

3.4. 一般状态情况观察及症状评分

雾化过程中观察大鼠的呼吸、毛发、体位、饮食、排泄等一般情况，并根据大鼠的症状进行评分：活动自如，呼吸平稳为0分；呼吸急促，未出现鼻翼煽动、腹肌紧张抽搐为0.5分；呼吸困难为1分；呼吸困难伴喷嚏、咳嗽为2分；张口呼吸，呼吸深长，口鼻尾紫绀为3分；休克、死亡为4分 [9] 。

3.5. ELISA法检测IL-6、IL-17、IL-10、IL-35细胞因子含量

血标本室温下静置30 min，设置3000 r/min离心20 min，取上清液，严格参照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、IL-17、IL-10、IL-35细胞因子含量。

3.6. 统计学方法

应用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料以( $\bar{x}\pm s$ )表示，满足正态分布的多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，方差不齐则采用Dunnett’s t3法；偏态分布则用多样本秩和检验；相关性分析采用Pearson检验；P < 0.05为差异有统计学意义。

4. 结果

4.1. 一般状态观察及哮喘症状评分

空白组大鼠呼吸平稳，皮毛光滑有色泽，进食排便正常；与空白组相比，模型组和全真一气汤低、高剂量组大鼠均出现腹式呼吸、呼吸急促、搔鼻、口唇发绀等症状，并伴有毛色暗沉无光泽，蜷缩嗜卧，腹肌痉挛，饮食减少，排便增多等行为状态改变，哮喘症状评分显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，全真一气汤低、高剂量组的哮喘症状评分显著降低(P < 0.05)。(如表1)

表1. 各组大鼠哮喘症状评分比较( $\bar{x}\pm s$ , n = 24)

与空白组比较，^*P < 0.05；与模型组比较，^△P < 0.05；与全真一气汤低剂量治疗组比较，^▲P > 0.05。

4.2. 血清IL-6、IL-17、IL-10、IL-35细胞因子含量

如图1，与空白组相比，模型组血清IL-6、IL-17含量明显增加(P < 0.05)，血清IL-10、IL-35的含量明显减少(P < 0.05)；与模型组相比，全真一气汤低剂量组、高剂量组血清IL-6、IL-17的含量明显减少(P < 0.05)，IL-35的含量明显增加(P < 0.05)；与全真一气汤低剂量组相比，全真一气汤高剂量组血清IL-6的含量减少(P < 0.05)，IL-35的含量明显增加(P < 0.05)。

图1. 各组大鼠血清IL-6、IL-17、IL-10、IL-35细胞因子含量比较

4.3. 哮喘症状评分与血清细胞因子含量的相关性研究

如表2，双变量Pearson检验结果显示，血清IL-17、IL-6与哮喘症状评分呈正相关(P < 0.05)，血清IL-10、IL-35与哮喘症状评分呈负相关(P < 0.05)。

表2. 各组大鼠哮喘症状评分与血清细胞因子相关性

5. 讨论

支气管哮喘，是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症及高反应的呼吸系统疾病 [10] ，最新的研究进展也表明，辅助性T细胞(Th17)和调节性T细胞(Treg)产生的炎性因子IL-6、IL-17、IL-35、IL-10能够控制或者诱导气道炎症 [11] 。徐玉等 [12] 的实验研究发现肾气虚型哮喘大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-17水平增高。Treg分泌的多种细胞因子如IL-10、IL-35等间接发挥作用，从而减轻哮喘气道炎症、气道高反应性及气道重塑的发生 [12] [13] [14] 。

哮喘属于“伏饮”范畴，以“痰”为夙根，而伏痰壅滞气道，气塞不通，血壅不流，痰瘀胶着于脉络，导致哮喘难以根治，痰饮伏藏多因脏气虚弱、功能失调，主要为肺脾肾三脏统领运化津液的能力减弱，尤以肾阳衰微蒸腾气化无权为重，正如陈士铎所说“气虚自然痰多”。水气不能转输盘踞一所，日久根深蒂固则为伏痰，若遇感受外邪等诱因，则可引动伏痰，伏痰上激于肺则喘促、痰涌鼻煽；伏痰横溢肌腠则浮肿、肌肤晦暗；伏痰下窜胃肠则食少、洞泄不止。全真一气汤具有明显的补肾气作用，并能明显改善肾气虚型哮喘患者的临床症状，改善肾气虚型哮喘大鼠的气道炎症 [15] [16] 。

本研究结果显示，肾气虚型哮喘大鼠一般状态情况越差，呼吸困难、口唇紫绀、毛发晦暗、排便增多等症状表现越明显，哮喘症状评分越高，促炎因子IL-6、IL-17的含量越高，抗炎因子IL-35、IL-10的含量越低，即气道炎症程度越明显，因此细胞因子IL-6、IL-17、IL-35、IL-10可以作为评估肾气虚型哮喘大鼠炎症程度的指标。

基金项目

福建省自然基金面上项目(2020J01245)。

文章引用

张 晶,吴晓晨,张家旺,谢雨捷. 肾气虚型哮喘大鼠气道炎症指标的研究
Study on Airway Inflammation Index in Asthmatic Rats with Kidney-Qi Deficiency[J]. 临床医学进展, 2023, 13(10): 15215-15220. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.13102128

参考文献