ABSTRACT

In this study, using the aptamer with excellent properties, the new and rapid detection methods of Ochratoxin A (OTA) has been developed with an evanescent wave all-fiber biosensor (EWAB). The method based on the high affinity and specificity between pollutants and aptamer, and both complementary strands and OTA completely bound with Cy5.5 labeled OTA aptamer in solution. The quantitative detection of OTA was achieved. The linear detection range of OTA was 0.13 μg/L - 2.89 μg/L, and the detection limit was 0.063 μg/L. The recoveries of spiked samples were from 80% to 120%.This paper show a high sensitivity, simple and fast detection method.

Keywords:Ochratoxin A, Aptamer, Evanescent Wave All-Fiber Biosensor

基于倏逝波核酸适体生物传感器的 赭曲霉毒素A的新型检测方法

吴君，李伟，龙峰^*

中国人民大学环境学院，北京

收稿日期：2017年5月9日；录用日期：2017年6月9日；发布日期：2017年6月12日

摘 要

本文结合核酸适体的优异性能，利用前期研发的倏逝波光纤生物传感器(Evanescent Wave All-fiber Biosensor, EWAB)，发展了赭曲霉毒素A (OTA)的新型快速检测方法。检测方法基于核酸适体与污染物质的特异性结合能力，利用溶液中的OTA与光纤探头表面的核酸适体互补链共同竞争OTA核酸适体，建立了核酸适体结构竞争法检测OTA的标准曲线，线性检测区间为0.13 μg/L~2.89 μg/L，检测限为0.063 μg/L。并对实际样品进行了检测，标回收率在80%~120%之间。实验结果表明此方法检测OTA具有良好的灵敏度，检测方法简便快速，并可以较好的应用于实际样品检测中。

关键词 :赭曲霉毒素A，核酸适体，倏逝波光纤生物传感器

1. 引言

环境监测是环境保护工作中重要的一环，随着环境污染问题的日益严重，环境监测工作者将面临更加严峻的挑战。为应对复杂的分析条件与多样的分析对象，环境监测仪器必须不断发展完善，才能满足日益增大的工作需求[1]。在近年来新兴的监测仪器中，生物传感器因具备简便快速、高灵敏、可实时连续检测的优点而备受瞩目[2]。本研究所使用的倏逝波核酸适体光纤生物传感检测平台(EWAB)，利用了倏逝波的光学特性，使用核酸适体作为生物识别元件，以全光纤传感作为信号转换系统，建立了风险污染物的新型快速检测方法。这种检测平台结构简单，器件轻巧便于携带，可进行野外和现场实时监测；具备这些优点的倏逝波核酸适体传感器，为环境检测仪器的发展提供了一种崭新的思路与方法，具有较好的研究价值。

核酸适体(Aptamer)是通过指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)人工合成的，高特异性高亲和性的寡核苷酸序列 [3] [4] [5] [6]。其具有不易变性、便于保存与运输、易于筛选合成、易于修饰靶物质范围广泛的优点，而成为新的研究热点 [7]。核酸适体可以通过静电作用力、氢键作用力、疏水堆积作用等，与靶物质特异性结合而形成特殊的空间结构，如G四聚体、发夹、茎环、口袋、假节、凸环等，从而形成稳定的复合物 [6]。赭曲霉毒素A(OTA)是一种真菌毒素次生代谢产物，由真菌(包括曲霉属和青霉属)生长繁殖过程中产生，常见于谷类食品和农作物中，如小麦、玉米、咖啡豆、香料、葡萄酒中、白酒、啤酒豆制品、罐头食品、茶叶中 [8]。赭曲霉毒素A具有肾脏毒性、免疫毒性、肝脏毒性、致畸变性 [9] [10]，OTA被国际癌症研究机构(IARC)认为对人类有潜在的致癌性(组2B)。我国国家食品安全标准中规定赭曲霉毒素A的检测标准为：谷类及其加工品、豆类及其加工品中OTA不得超过5 μg/kg，欧盟规定其在谷类中残留限量为3 μg/kg，辣椒中残留限量为15 μg/kg，小麦中残留限量为8 μg/kg [11]。

常见OTA的检测方法有：高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)，气相色谱法(Gas Chromatography, GC)，毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis, CE)，薄层色谱法(Thin Layer Chromatography, TLC)，光谱法(Spectroscopy Method)，酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)等 [12] [13] [14] [15]。这些常见的监测仪器具有灵敏度高、性能稳定成熟等优点，但是当其在实际检测过程中具有一些局限性：如占地大，不能进行原位实时监测；操作繁琐，图谱复杂，需要专业人员进行操作与分析；样品需要前过程处理，分析耗时长；价格昂贵，分析成本高等 [16]。而本研究利用的EWAB可进行快速、高效、简便、结果直观的实时原位检测，弥补了大型仪器在实际应用中的不足，具有广阔的应用前景。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

3-三乙氧基硅丙基琥珀酰胺(TEPSA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、赭曲霉毒素A(OTA)购自Sigma中国公司。浓硫酸、过氧化氢、甲苯、盐酸购自北京化学试剂公司，均为分析纯或更高。核酸序列购自上海生工集团，序列如下：

Cy5.5荧光基团标记的OTA核酸适体：

5’-Cy5.5-AGATC GGGTG TGGGT GGCGT AAAGG GAGCA TCGGA CA-3’

带氨基的OTA核酸适体互补链：

5’-NH₂–AAAAAAAAAAAATGTCCGATGCTC-3’

核酸序列使用前利用离心机进行离心(10,000 rpm × 1 min)，随后用超纯水溶解，震荡混匀，放置在−20℃的冰箱中储存备用。

0.5% SDS溶液(pH = 1.9)，10 mM Tris-HCl缓冲溶液(120 mM NaCl + 10 mM CaCl₂ + 5 mM KCl，pH = 6)，以上两种溶液由超纯水配制。

白酒(北京二锅头，清香型，酒精度56%)瓶装饮用水(农夫山泉)。

多模石英光纤(芯径600 μm，南京春辉)。

2.2. 实验仪器

本文所采用的仪器为课题组前期研发的便携式倏逝波全光纤生物传感器 [17]。该仪器主要包括器件有：激光器(波长为635 nm、输出功率为8 mW)，用于发射激光；单多模光纤耦合器(NA为0.22，芯径600 μm)，用于传递激光、激发与收集荧光，这些过程都在光纤内完成，简化了传光学传感器中的光路系统；样品池，样品池内安装光纤探头，并在其表面固定生物识别元件；蠕动泵，用于自动化进样；滤光片；光电二极管，用于将收集到的荧光信号并进行电信号转换；锁相放大器，适宜放大信号；计算机，用于信号的处理及系统控制。

其工作原理是将生物识别元件固定在光纤探头上，由固定波长的脉冲激光器发射激光，单多模光纤耦合器能够将激光传递至样品池中的光纤探头上，在光纤探头表面将会产生倏逝波，并激发其表面附近生物识别元件的荧光物质，荧光被激发后部分荧光耦合回光纤探头，单多模光纤耦合器将对荧光进行收集，荧光信号将被光电二极管接受并转换为电信号，经锁相放大器将放大信号，通过信号处理系统收集并处理电信号，完成样品的检测。倏逝波的入射距离为几十到几百纳米，因此溶液中游离的荧光分子的干扰较小。本仪器具有轻便、高效、灵敏、操作简便、无需样品前处理、结果表现直观等优点。仪器内部结构示意图与外观图如图1所示。

离心机、恒温干燥箱、电子显微镜、氮吹仪。

2.3. 实验方法

2.3.1. 光纤探头的修饰

将6 cm长，芯径600 μm的石英光纤削去约3 cm长的涂覆层，使用30%氢氟酸浸泡光纤无涂覆层覆盖部分和部分涂覆层覆盖部位3 h，氢氟酸液会通过毛细作用腐蚀涂覆层覆盖部分的石英纤芯，与未被涂覆层覆盖的部分形成一定的锥角，得到组合锥形光纤探头。配制piraha溶液(v H₂SO₄: v H₂O₂ = 3: 1)，将

图1. 倏逝波全光纤生物传感器示意图：(a) 内部结构图；(b) 外观图

组合型光纤探头浸入其中30 min，随后放入超声波清洗仪中洗涤，并使用超纯水进行清洗，直至清洗液的pH值为中性。使用氮吹仪吹干光纤，向15 mL的比色管中加入10 mL 2%的3-Triethoxysilylpropyl succinic anhydride (TEPSA)/无水甲苯溶液，将处理好的光纤加入其中反应2 h，而后用无水甲苯洗三遍，用水冲洗三遍，然后放入纯水中放置2 h，此时光纤上修饰了氨基基团；将羧基化的光纤放入含50 mM NHS和200 mM EDC的溶液中，反应4 h活化羧基基团；直接取出活化后的光纤，放入500 μL of 0.5 μM带氨基的OTA核酸适体互补链溶液(5’-NH₂–AAAAAAAAAAAATGTCCGATGCTC-3’)，反应过夜，取出光纤，用PBS缓冲溶液冲洗，再用0.5 mg/mL氨基乙醇封闭光纤，取出，放置4℃冰箱保存备用(制备过程如图2)。

2.3.2. 建立检测方法

将修饰完成的光纤探头安装在EWAB样品池中，使用10 mM Tris缓冲溶液配制100 nMCy5.5荧光基团标记的OTA核酸适体，将OTA核酸适体与缓冲溶液等比例混合，取300 μL混合液利用蠕动泵通入EWAB样品池，与光纤探头表面的互补链杂交300 s，EWAB能够检测到结合在光纤表面的核酸适体的荧光信号，此时响应的信号值为空白对照值。将OTA核酸适体与不同浓度OTA标准品等比例混合后，静置(预反应)适宜时间，OTA核酸适体与OTA将进行特异性结合，核酸适体发生适应性折叠，结合位点被占据，随后取300μL混合液通入EWAB样品池，与光纤上的杂交链结合300 s，记录EWAB检测到的荧光信号值，并与空白对照值进行比较。每组样品重复3次，取平均值。这种方法中光纤探头上的互补链和溶液中OTA将同时竞争结合Cy5.5标记的OTA核酸适体，因此称这种方法为核酸适体结构竞争法，原理图如图3。

2.3.3. 制作标准曲线

按照上述检测方法对0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 μg/L不同浓度梯度的OTA标准品进行检测，平行样品间重复3次，并将EWAB检测的荧光信号归一化处理，使用origin软件进行Logistic四参数模型(常用生物方法中标准曲线的拟合模型)进行拟合，获得核酸适体非特异性吸附法检测OTA的标准曲线。

2.3.4. 实际样品的检测

本研究选取白酒作为实际样品，进行两个浓度的OTA加标-回收试验。取白酒适量，使用10 mM Tris缓冲溶液稀释10倍，添加OTA标准品至稀释后的样品中，使其浓度为0.2 μg/L，0.75 μg/L。按照上述实验方法对样品进行检测，记录荧光信号值。将测得的信号值带入标准曲线拟合所获得方程式中，进行

图2. 光纤探头的制备步骤示意图

图3. 核酸适体结构竞争法检测OTA原理示意图

定量计算。对每组平行样品重复3次，结果取平均值。

3. 实验结果与讨论

3.1. 建立检测方法与绘制标准曲线

利用OTA核酸适体结构竞争法进行OTA的检测，EWAB检测的实时检测曲线如图4。由图可知，OTA核酸适体分别与0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 μg/L的OTA标准品反应后，EWAB检测到的荧光信号值发生了不同程度的下降，OTA标准品的浓度与荧光信号值呈反比关系。这是因为Cy5.5标记的核酸适体与OTA结合后，结合位点被占据，结构发生了适应性折叠，因此与光纤上的互补链结合量减小，导致EWAB检测到的荧光值下降。

随后将检测各浓度OTA标准品的荧光信号经归一化处理，通过origin软件中Logistic四参数模型对曲线进行拟合，模型如下

$Y=\frac{A_1-A_2}{1+\left(X/X_0\right)}+A_2$ (1)

其中X、是待测物(标准品)的浓度，Y是X对应的信号值；A₁、A₂为常数，分别对应曲线上端渐近线(X = 0)和下端渐近线(X → ∞)；X₀是常数，为曲线中点，又称拐点；P是曲线拐点处斜率，为拟合常数。定义最大信号的80%到20%时的区域为检测区间，最大信号的90%时浓度值为检测限。

在半对数体系下作出检测OTA标准样品的反S曲线，如图5，即为核酸适体结构竞争法使用100 nM OTA核酸适体检测OTA的标准曲线，线性检测区间为0.13 μg/L~2.89 μg/L，检测限为0.063 μg/L。

3.2. 实际样品的检测

根据所绘制的标准曲线，使用核酸适体结构竞争法对白酒中的OTA进行加标回收实验，并将所获得的荧光信号值带入绘制标准曲线所得到的公式中进行定量分析。并对样品的加标回收率进行计算，计算方法如下：

$P\left(\%\right)=\left(C_2-C_1\right)/C_3\times 100\%$ (2)

其中P为样品加标回收率；C₁为样品原始浓度的均值；C₂为加标后样品浓度的均值；C₃为实际的加标浓度。

获得检测实际样品中OTA的实验结果如表1。在实际样品检测中，白酒中的加标回收率在80%~120%

图4. EWAB响应的不同浓度OTA的荧光信号值

表1. 核酸适体结构竞争法进行OTA实际样品加标-回收实验结果

图5. 核酸适体结构竞争法检测OTA的标准曲线

之间，表明此方法能够较好的应用到实际样品的检测中。

文章引用

吴君,李伟,龙峰. 基于倏逝波核酸适体生物传感器的赭曲霉毒素A的新型检测方法
A Novel Detection Method of Ochratoxin A with Evanescent Wave All-Fiber Aptamer Biosensor[J]. 环境保护前沿, 2017, 07(03): 18-25. http://dx.doi.org/10.12677/AEP.2017.73B003

参考文献 (References)