青岛大学附属医院儿童血液肿瘤科，山东 青岛

收稿日期：2022年10月3日；录用日期：2022年10月31日；发布日期：2022年11月7日

摘要

目的：探讨MTHFR A1298C和C677T基因多态性对儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者甲氨蝶呤(MTX)耐受性的影响。方法：选取2020年9月至2021年9月于青岛大学附属医院确诊并接受CCCG-ALL2020方案治疗的42例ALL患者，检测患者的MTHFR基因型，结合临床资料分析基因多态性对ALL治疗中HD-MTX方案耐受性的影响。结果：42例患儿中，MTHFR A1298C：AA型27例(64.28%)，AC型15例(35.71%)，未检测到纯合突变型(CC型)；MTHFR C677T：CC型10例(23.8%)，TT型14例(33.33%)，CT型18例(42.85%)。MTHFR A1298C基因不同基因组的MTX化疗不良反应和药代动力学的发生率比较差异均无统计学意义(均P > 0.05)。MTHFR C677T基因多态性与血红蛋白下降、谷丙转氨酶升高和药代动力学方面具有统计学意义(P < 0.05)，而在其他不良反应方面均无统计学意义(P > 0.05)。结论：MTHFR基因多态性不能被视为MTX的毒性标志物，我们可关注其他基因，如转运基因。

关键词

亚甲基四氢叶酸还原酶，甲氨蝶呤，不良反应，血药浓度

Effect of MTHFR Gene Polymorphism on Methotrexate Tolerance in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia

Shenghan Gao, Yanxia Zhao^*, Xinlin Liu, Ruiqi Zhang

Department of Pediatric Hematology and Oncology, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong

Received: Oct. 3^rd, 2022; accepted: Oct. 31^st, 2022; published: Nov. 7^th, 2022

ABSTRACT

Objective: To investigate the effect of MTHFR A1298C and C677T gene polymorphisms on methotrexate (MTX) tolerance in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods: Forty-two ALL patients diagnosed and treated with CCCG-ALL2020 regimen in Affiliated Hospital of Qingdao University from September 2020 to September 2021 were selected. The MTHFR genotype of the patients was detected, and the effect of gene polymorphism on the tolerance of HD-MTX regimen in ALL treatment was analyzed combined with clinical data. Results: Among the 42 children, 27 cases (64.28%) were MTHFR A1298C: AA type, 15 cases (35.71%) were AC type, and no homozygous mutation (CC type) was detected; MTHFR C677T: CC type in 10 cases (23.8%), TT type in 14 cases (33.33%), CT type in 18 cases (42.85%). There was no significant difference in the incidence of adverse reactions and pharmacokinetics of MTX chemotherapy among different genomes of MTHFR A1298C gene (all P > 0.05). MTHFR C677T gene polymorphism was significantly associated with hemoglobin decrease, alanine aminotransferase increase and pharmacokinetics (P < 0.05), but not with other adverse reactions (P > 0.05). Conclusion: MTHFR gene polymorphism cannot be regarded as a toxicity marker of MTX. We should pay attention to other genes, such as transport genes.

Keywords:MTHFR, MTX, Adverse Reactions, Blood Drug Concentration

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1. 引言

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是一种以骨髓和外周血中原始淋巴细胞增殖为特征的血液系统恶性肿瘤，是儿童中最常见的恶性肿瘤形式，占所有儿童恶性肿瘤的30%。在过去的几十年里，由于治疗方案的不断改善，儿童ALL的存活率显著提高。甲氨蝶呤(MTX)作为抗代谢药物之一，是巩固和维持治疗中最常用的药物之一。然而MTX的治疗通常受到其严重毒性的限制，因此，研究MTX相关的毒性发生的预测因子是必要的。有证据证明，亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)的遗传多态性可能会影响MTX相关的毒性。MTHFR是MTX药代动力学的关键酶，将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸。MTHFR A1298C (rs1801131)和C677T (rs1801133)是2个最常见的多态性位点，其多态性会影响该酶的活性 [1]。现已被广泛认定为MTX毒性和预后的潜在标志物。具有677CT和677TT基因型的人分别表现出正常MTHFR活性的60%和30% [2]，而1298CC个体则具有60%的MTHFR活性 [3]。迄今为止，多个机构已经研究了MTHFR多态性与MTX毒性的潜在作用以及在儿童ALL中的结果，但结论仍有争议。一些研究没有发现关联，而另一些研究在关联性方面则具有相反的结果。

本研究中，我们回顾性分析了42例ALL儿童在进行HD-MTX治疗期间MTHFR C677T和A1298C多态性对MTX相关毒性及血浆浓度之间的相关性。

2. 资料与方法

2.1. 临床资料

选取2020年9月至2021年9月青岛大学附属医院儿童血液肿瘤科收治的进行大剂量MTX治疗的42例初诊ALL患儿为研究对象。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准。所有患儿及其法定监护人均签署知情同意书。

诊断与入选标准：根据形态学–免疫学–细胞遗传学–分子生物学(MICM)诊断，根据CCCG-ALL2020方案 [4] 进行规律化疗，在诱导治疗后骨髓象达到完全缓解(CR)，MRD ≤ 0.01%。进行四次HD-MTX方案为基础的巩固治疗。

2.2. 药品与方法

甲氨蝶呤注射液，剂型：注射剂；规格[2 ml: 50 mg]；批准文号：注册证号H20140205；生产厂家Pfizer(Perth)Pty Limited。

DNA提取及遗传分析：提取患儿DNA后测定其浓度和光密度比，通过设计引物、PCR扩增、电泳检测等步骤，对扩增的PCR产物进行检测及纯化。最后采用荧光原位杂交技术进行图像扫描，用TL 998A染色体核型分析系统系统分析图像，判断基因型。

MTX血药浓度测定：分别于静脉滴注HD-MTX后第20、44小时采取患儿2 ml外周血与EDTA抗凝管中，采用酶放大免疫分析法检测MTX血药浓度。

2.3. 治疗方法

参考CCCG-ALL2020方案对ALL患儿进行规律化疗，巩固期大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)使用剂量如下：低危患儿3 g∙m⁻²，中、高危患儿5 g∙m⁻²。

2.4. 不良反应评估

参照美国国立癌症研究所常规毒性判定标准(第3版)，评定患儿每次在进行HD-MTX化疗前和化疗后I级及以上的MTX化疗相关毒副作用。

2.5. 观察指标

回顾性分析42例ALL患者4个周期的HD-MTX方案治疗期间的血常规、肌酐清除率、肝肾功检查结果及20、44小时MTX浓度。与化疗前相比，临床检测项目，如白细胞(WBC)、中性粒细胞(ANC)、血红蛋白(Hb)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)，每升高或降低一个或多个等级被认为存在不良反应。

2.6. 统计学处理

使用SPSS 25.0软件进行统计分析。用c2检验分析不同MTHFR C677T和A1298C基因患儿在进行HD-MTX化疗后20、44小时血浆浓度及ADR发生情况的差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 一般资料

在纳入的42例患儿中，其中男25例(59.52%)、女17例(40.47%)；低危22例(52.38%)，中、高危20例(47.61%)；T-ALL 3例(7.14%)、B-ALL 39例(92.85%)。见表1。

表1. 42例儿童ALL患者的临床特征

3.2. MTHFR基因分布情况

对所有入组患儿进行基因分型检测，结果如下：MTHFR A1298C：AA型27例(64.28%)，AC型15例(35.71%)，未检测到纯合突变型(CC型)；MTHFR C677T：CC型10例(23.8%)，TT型14例(33.33%)，CT型18例(42.85%)。MTHFR A1298C突变型组(AC + CC型) 15例(35.71%)，野生型(AA型) 27例(64.28%)，两组之间在性别、免疫分型、危险度均无统计学意义(P值均 > 0.05)。见表2。

表2. 基因分型在各组分布情况[例(%)]

3.3. 基因多态性对患者骨髓抑制及肝肾功损害的影响

42例ALL患儿经4次HD-MTX后，发生WBC下降62例，ANC下降39例，HB下降40例，ALT升高67例，AST升高73例，Cr升高2例。MTHFR A1298C基因多态性和HD-MTX化疗后骨髓抑制及肝肾功损害无相关性(均P > 0.05)，见表3。MTHFRC677T基因多态性与HD-MTX化疗后HB下降及ALT升高具有相关性(P < 0.05)，提示突变型(CT + TT)发生HB下降和ALT升高的发生率较CC型高。余指标无相关性(P > 0.05)，见表4。

表3. MTHFR A1298C基因多态性和HD-MTX化疗不良反映的关系

表4. MTHFRC677T基因多态性和HD-MTX化疗不良反映的关系

3.4. 基因多态性对患者HD-MTX化疗后20、44小时浓度的影响

42例ALL患儿经4次HD-MTX后，第20小时浓度发生异常有68例，第44小时浓度发生异常有34例。MTHFR A1298C不同基因型MTX化疗后不同时间的血药浓度异常发生率比较差异无统计学意义(均P > 0.05)，见表5。MTHFR C677T基因在MTX化疗后20小时浓度具有统计学意义，见表6，提示突变型(CT + TT)发生浓度异常的发生率较CC型高。

表5. MTHFR A1298C基因多态性和MTX浓度异常的关系

表6. MTHFR C677T基因多态性和MTX浓度异常的关系

4. 讨论

MTX是一种叶酸类似物，通过还原叶酸载体(RFC1)介导的主动转运进入细胞，抑制二氢叶酸还原酶从而抑制叶酸循环。MTHFR是细胞内叶酸稳态和代谢的关键酶，其作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸，在DNA的甲基化、合成和修复中起着关键作用 [5]。MTHFR基因编码区域存在多个单核苷酸多态性(SNP)可能导致MTHFR活性在不同程度上下降。A1298C (rs1801131)和C677T (rs1801133)是MTHFR常见的多态性位点，这可能会降低MTX的生物活性，改变白血病细胞对药物的敏感性，调整叶酸拮抗剂化疗的反应 [6]，影响体内的血药浓度，并改变MTX的疗效和预后。而另一个多态位点MTHFR G1793A (rs2274976) [7] 可能会影响蛋白质的结构和功能，但是否会影响MTHFR的活性有待确定。

在本次研究中，我们评估了MTHFR基因多态性对儿童ALL患者MTX耐受性的影响。国内外研究报道MTHFR A1298C等位基因频率分布存在差异，如日本、夏威夷和高加索人群的基因频率分别为21.0%、23.0%和30.7%，而中国人群为16%~17% [8]。本研究中MTHFR A1298C 突变基因型频率17.9%，接近之前相关报道。MTHFR突变的频率差异可能与干扰基因组结果的种族和环境因素有关，然而缺乏关于一些流行病学决定因素(环境、饮食、风险群体等)的数据，对这些因素结合的研究很少。本研究发现MTHFR A1298C各基因型与ALL儿童的MTX化疗不良反应和血药浓度的相关性并无统计学意义，该研究结果与Lopez-Lopez等和Rim Frikha [9] 等的研究结果一致。而白小红等 [10] 研究认为MTHFR A1298C各基因型与大剂量MTX化疗后的胃肠道反应、黏膜损伤等 ADR 发生风险相关，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，而与骨髓抑制、肝损害等ADR发生风险无关，差异均无统计学意义(均P > 0.05)。同样Maitance Umerez [6] 等系统综述中得出结论，MTHFR多态性与MTX毒性之间无关联性，偶有少数具有关联的研究却经常得到相反的结果，如Fukushima [11] 认为A1298C (CC型)较AA型患者的肝毒性风险低，而部分研究者认为CC型基因使肝功能受损的发生率提高。因此认为MTHFR多态性不是预测MTX化疗毒性的标志物。

本研究结果显示，C677T基因多态性与MTX肝毒性及血红蛋白降低风险增加相关，该研究结果与Hagleitner [12] 的分析结果一致。Haase [13] 等人表明C677T的突变与毒性降低有关，而Zgheib [14] 等人发现了相反的效果。而朱忱等 [15] 研究发现MTHFR C677T多态性在肝功损害、骨髓抑制、黏膜损伤方面均布不存在显著相关性，但单个研究显示，非洲人群在其方面，C677T等位基因相对于其他人种而言具有较明显的保护作用。在血浆浓度方面，本研究显示C677T多态性与大剂量化疗后20小时浓度具有相关性，这与Mahmoud等的研究一致，认为C677T基因分型可用于预测MTX毒性。而陈先睿 [4] 则认为MTX血浆浓度异常与该基因突变无关联性。这可能与是与化疗后给予亚叶酸钙解救在一定程度上降低了血同型半胱氨酸水平有关。上述研究表明目前国内外研究结果的差异可能受到种族差异基因频率、化疗合用药物、个体叶酸水平、环境及样本量等影响。

本研究存在病例数相对不足、观察指标未覆盖甲氨蝶呤常见毒副作用，使得本研究存在局限性，需行进一步探索研究。

5. 结论

综上所述，MTHFR C677T和A1298C多态性与儿童ALL之间存在较弱的相关性，不能被视为MTX的毒性标志物。因此，我们可关注在其他基因上。如转运基因，Treviño [16] 等人对ALL患者进行了全基因组关联研究，发现SLCO1B1中的rs4149081和rs11045879与MTX首次清除密切相关，在MTX转运体中的多态性分析上，发现SLC19A1、ABCC4和ABCC2等基因中的几个SNP也与MTX水平和其他毒性有关 [17]。

文章引用

高胜寒,赵艳霞,刘欣琳,张瑞祺. MTHFR基因多态性对儿童急性淋巴细胞白血病患者应用甲氨蝶呤耐受性的影响
Effect of MTHFR Gene Polymorphism on Methotrexate Tolerance in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia[J]. 临床医学进展, 2022, 12(11): 9891-9897. https://doi.org/10.12677/ACM.2022.12111427

参考文献