ABSTRACT

[Objective]: Isolation and phylogenetic analysis of Pb²⁺ and Cd²⁺ tolerance strains from Gejiu mining soil of Yunnan. [Methods]: Microbial strains and their tolerance heavy metals of Cd²⁺ and Pb²⁺ by using the plate separation method, Phylogenetic analysis of Cd²⁺ and Pb²⁺ Tolerance strains based on 16SrDNA and ITS gene sequence. [Results]: 57 strains of Cd²⁺ tolerant microorganisms were isolated by using three media, including 39 bacteria, 18 fungi; 161 strains of Pb²⁺ tolerant microorganisms were isolated, including 121 bacteria, 48 bacteria. The tolerance of 178 strains of bacteria to 100 mg/L Cd²⁺ and 2000 mg/L Pb²⁺ were 28.9% and 32.2% respectively. The tolerance of fungi to 1000 mg/L Cd²⁺ was 27.6%, and the tolerance of fungi to different concentrations of Pd²⁺ was 25.0%. The tolerance of strains to Pb²⁺ was significantly better than that of Cd²⁺. Through phylogenetic analysis of 16SrDNA and ITS gene sequence, it confirmed S73-1 strain as Enterobacter, S156-1 as Acinetobacter and IS73-1 as Rhizopus.

Keywords:Mining Area, Cd²⁺ Resistance Strain, Pb²⁺ Resistance Strain, Phylogenetic Analysis

云南省个旧市矿区耐镉和铅菌株的分离、鉴定及系统发育分析

陶宗苹，王田涛，张德刚，王传铭，施娴^*

红河学院，生命科学与技术学院，云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南 蒙自

收稿日期：2019年5月27日；录用日期：2019年6月11日；发布日期：2019年6月18日

摘 要

[目的]：通过对云南省个旧市矿区周边进行土壤采样，筛选出耐Cd²⁺和Pb²⁺菌株并且对其Cd²⁺和Pb²⁺耐受性进行评价和系统发育分析。[方法]：采用平板法进行微生物菌株分离和Cd²⁺、Pb²⁺耐受性评价，基于16SrDNA和ITS序列对耐受Cd²⁺和Pb²⁺菌株进行系统发育分析。[结果]：共筛选到耐重金属Cd²⁺微生物57株，其中细菌39株，真菌18株；耐重金属Pb²⁺微生物161株，其中细菌121株，真菌40株。对178株菌株耐受性研究发现，细菌在100 mg/L Cd²⁺浓度和2000 mg/L Pb²⁺浓度下耐受性最好，达28.9%和32.2%，真菌在1000 mg/L Cd²⁺浓度耐受性最好，达27.6%，真菌在不同Pd²⁺浓度处理下耐受性均表现出一致为25.0%。菌株对Pb²⁺的耐受性明显好于Cd²⁺。通过16SrDNA和ITS序列和系统发育分析，经鉴定S73-1菌株属于肠杆菌属(Enterobacter)细菌，S156-1为不动杆菌属(Acinetobacter)细菌，IS73-1为根霉属(Rhizopus)真菌。

关键词 :矿区，镉抗性菌株，铅抗性菌株，系统发育分析

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1. 引言

云南省个旧市是我国有名的“锡都”，具有历史记载的矿业发展有二千多年的历史。由于长期利用土法炼矿，导致矿区周边的环境受到严重破坏。郑国强等 [1] 研究矿区土壤时发现Pb属于强度污染。黄玉 [2] 等研究个旧矿区矿业活动对土壤重金属的累积贡献，结果表明矿业活动区重金属累积贡献率排序为Pb > Zn > As > Cu > Cd > Cr > Hg，Pb、Cd、As、Zn、Cu与矿业活动关系密切，矿业活动区Pb、Cd、As均表现为极高累积和极高风险。宋雁辉等 [3] 在研究中发现个旧乍甸的农田土壤中Pb、Zn、Cu、Cd、As的含量均已超出《土壤环境质量标准》 (GB15618-1995)二级标准；米艳华等 [4] [5] 研究发现，矿区蔬菜、玉米等作物中均有重金属Pb、Cd和As的检出，对人体健康存在潜在的健康风险。众多的研究表明，矿区矿产作业破坏了当地的生态环境，带来的土壤重金属污染对当地居民的生活影响越来越大，对于矿区土壤重金属污染的治理，已到了刻不容缓的地步。微生物修复方法在治理重金属污染方面表现出菌种来源丰富、低成本、无二次污染等方面的优势，具有较大的应用前景 [6] 。抗性细菌能够通过特异性生物吸附、富集活化等多种方式减少重金属的污染，尤其适用于治理土壤低浓度或大面积重金属污染。因此，有针对性地筛选抗Cd²⁺和Pb²⁺菌株，研究探索其抗Cd²⁺和Pb²⁺机制，对于农田土壤环境中重金属污染的治理具有一定的理论意义 [7] [8] [9] [10] 。肖炜等 [11] 在研究云南个旧锡矿区可培养细菌多样性及其重金属抗性时发现，个旧锡矿区土壤可培养细菌具有丰富的多样性，而且蕴含着不少潜在新类群，该环境中含有大量Cd²⁺和Pb²⁺耐受菌株，并对Cd²⁺和Pb²⁺具有较强的抗性或适应性。因此，试验从云南个旧市矿区受重金属污染土壤中采样，分离纯化具有耐受Cd²⁺和Pb²⁺菌株，并通过形态观察及系统发育分析，了解耐受Cd²⁺和Pb²⁺菌株特性，旨在为将来更好地治理土壤中重金属污染提供基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料

重金属污染土壤来自于云南个旧矿区周边土壤。耐Cd²⁺和Pb²⁺菌株筛选与纯化培养基：细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基 [12] 、真菌采用马铃薯培养基 [12] 、放线菌采用高氏一号培养基 [12] 。

2.2. 试验方法

2.2.1. 菌株的分离、纯化

称取各土壤25 g置于盛有225 ml灭菌水和玻璃珠的三角瓶中，在转速180 r/min的摇床上振荡30 min，制得土样悬液，然后用无菌水进行6倍梯度稀释。取1 ml 10⁻³~10⁻⁵稀释度的土壤悬液涂布平板，于28℃培养，每天观察并记录各培养基上的微生物生长情况及数量。7~30 d后挑选出的合适的菌液浓度的菌株接种到相应的培养基上，倒置于26℃的恒温培养箱中培养纯化3~4天。

2.2.2. 耐重金属Cd²⁺和Pb²⁺菌株的筛选

将纯化好的菌株点接到Cd²⁺和Pb²⁺浓度为100 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、2000 mg/L的相应培养基上观察它们生长与否及生长程度，实验重复3次。

2.2.3. 耐重金属Cd²⁺和Pb²⁺菌株的形态观察与鉴定

分离获得的细菌和真菌分别接种到牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯培养基平板中央，28℃培养10 d，观察菌落形态。筛选出的耐重金属Cd²⁺和Pb²⁺菌株送上海生工生物工程有限公司测序。将序列进行Blast序列分析，确定各菌株边缘种及相似性。使用MEGA 5.2软件构建系统发育树。

2.3. 数据分析

实验数据采用Excel 2013分析，利用SPSS 20.0进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan检验多重比较(P < 0.05)，结果以平均值±标准差表示。

3. 结果与分析

3.1. 耐重金属Cd²⁺和Pb²⁺菌株的筛选

经过固体培养基及多次的筛选和划线纯化后，共筛选到耐重金属Cd²⁺微生物57株，其中细菌39株，真菌18株，放线菌0株；耐重金属Pb²⁺微生物161株，其中细菌121株，真菌40株，放线菌0株。由图1数据可见到，筛选培养的细菌和真菌耐受Cd²⁺和Pb²⁺的浓度均达到2000 mg/L。但各处理各菌株表现出差异，由图1(a)可知，细菌在不同Cd²⁺浓度下耐受性表现出100 mg/L处理最好达28.9%，其次为2000 mg/L处理为27.1%，经过方差分析两个处理之间未达显著差异；真菌表现出在1000 mg/L浓度处理下最好达27.6%，其次为2000 mg/L处理为23.8%，经方差分析两个处理未达显著差异。由图1(b)可见，细菌在不同Pd²⁺浓度下表现耐受性不同，各处理表现为2000 mg/L > 100 mg/L > 500 mg/L > 1000 mg/L，经过方差分析细菌在2000 mg/L处理下的耐受性与100 mg/L处理未达显著差异，与500 mg/L和1000 mg/L处理达显著差异；真菌在不同Pd²⁺浓度处理下耐受性均表现出一致为25.0%。结果说明，矿区土壤在长期受重金属污染的情况下，细菌、真菌对重金属Cd²⁺和Pb²⁺产生了不同的抗性。

3.2. 耐重金属Cd和Pb菌株的形态观察

3.2.1. 耐重金属Cd菌株形态观察

从筛选出的所有菌株中选取1株耐受Cd的细菌进行形态观察，该细菌为100 mg/L处理，编号为S73-1。由图2可看出，该菌株从形态观察上看呈乳白色，菌落呈圆形，边缘光滑整齐。经过细菌革兰氏染色显微形态观察该细菌为红色，所以属于革兰氏阴性菌，杆状。

图1. 不同Cd²⁺和Pb²⁺浓度下菌株的耐受性

图2. S73-1菌株菌落形态

3.2.2. 耐重金属Pb菌株形态观察

从筛选出的所有菌株中选取长势最好的一株细菌(编号S156-1)和一株真菌(编号IS73-1)进行形态观察。如图3可知，筛选培养的细菌菌落形态及特征，均为粘液性型菌株，落呈淡黄色，呈圆形，表面光滑经过革兰氏染色法对筛选细菌染色鉴定，被测细菌为革兰阴性球杆菌，常见成对排列，无芽孢，无鞭毛。

如图4可知，筛选培养的真菌菌落形态及特征，菌落中心菌株的颜色最初为白色，后随着菌株生长使菌落色发生变化，变为淡黄色或灰褐色，菌株分布类似同心圆状向四周呈丝状散开生长，菌落边缘比较稀松。孢囊梗直立或稍弯曲，2~4株成束，与假根对生，有时膨大或分枝，呈褐色，孢囊孢子呈椭圆形，其形状、大小不一致。可明显观察出该真菌与根霉属真菌相似性高。

图3. S156-1菌株菌落形态

图4. IS73-1菌株菌落形态

3.3. 耐Cd和Pb菌株的16SrDNA和ITS序列分析

由图5可知，可测定耐Cd²⁺菌株S73-1的16SrDNA序列全长为1503 bp。将经测序得到的序列进行Blast序列分析，S73-1菌株属于肠杆菌属(Enterobacter)，同源性达到99%。对耐Pb²⁺细菌IS73-1的16SrDNA基因和S156-1 ITS的扩增和测序，得到S156-1的扩增物长度为1359 bp，IS73-1的扩增物长度为604 bp，将测序结果进行BLAST在线对比，结果表明编号S156-1的菌株与不动杆菌属(Acinetobacter pittii)微生物的同源性为100%。菌株IS73-1对比结果表明与根霉属(Rhizopus)的同源性为100%。

图5. S73-1、IS73-1和S156-1 16S rDNA和ITS基因序列PCR结果

3.4. 耐Cd和Pb菌株的系统发育分析

将S73-1和IS73-1的16SrDNA和S156-1的ITS序列构建系统发育树进行进一步的种属鉴定(图6)。结果表明菌株S73-1在系统发育树上可以划分为肠杆菌属(Enterobacter)，菌株S73-1与鲁氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii strain LY-62)在系统进化树上处于同一分支，序列同源性达99%。菌株S156-1在系统发育树上划分到不动杆菌属(Acinetobacter pittii)，菌株S156-1与皮特不动杆菌在系统进化树上处于同一分支，序列同源性达100%。菌株IS73-1在系统发育树上划分到根霉属(Rhizopus)，菌株IS73-1与米根莓菌(Hizopus oryzae)在系统进化树上处于同一分支，序列同源性达到100%。

图6. S73-1、S156-1和IS73-1的16SrDNA和ITS基因序列系统发育树

4. 讨论与结论

本试验通过从云南个旧矿区受重金属污染的土壤中进行耐重金属耐Cd和Pb微生物筛选，筛选培养的耐重金属Cd²⁺和Pb²⁺细菌和真菌耐受性均达到20,000 mg/L浓度处理，放线菌的耐受性低于100 mg/L浓度处理。说明个旧矿区土壤在长期受重金属污染的情况下，细菌和真菌对重金属Cd²⁺和Pb²⁺产生一定的抗性，因为重金属污染对农用土壤中微生物类群动态变化的影响是多样的 [13] [14] [15] ，可使微生物的基因发生突变，以适应重金属污染的土壤环境。而在Cd²⁺和Pb²⁺浓度为2000 mg/L的条件下，长出的细菌菌株数量明显多于真菌，这就说明细菌对镉和铅的耐受性强于真菌。筛选得到的结果与沈国清等 [16] 报道的10 mg/kg土壤中细菌、真菌对镉产生的耐性作用大小为细菌 > 真菌基本相符。本研究中未能筛选出放线菌，可能是因为重金属Cd和Pb的浓度超出了个旧矿区土壤中的放线菌对重金属Cd和Pb的最大耐受性，除此之外也可能是因为矿区土样中存在的放线菌数量极少，未能成功筛选出来。丁自立 [4] 等在研究中发现放线菌对镉的耐性最高才达到45 mmol/L，所以说明放线菌对镉的耐受性很弱，当Cd²⁺为100 mg/L时，放线菌无法生长。我们发现来自个旧矿区的耐受Pb的微生物菌株数多于耐受Cd的菌株数。这与卞光凯 [17] 等对沿海滩涂耐盐植物内生细菌的重金属耐受情况相似，他们的结果显示能够耐受Pb²⁺的菌株数明显多于耐受Cd²⁺的菌株数。

而想利用从重金属污染的土壤中筛选得到的微生物来修复重金属污染的土壤，就必须知道筛选出的微生物种类、分属及以上单位。从所采集土样中筛选3株微生物，其中1株耐Cd细菌S73-1，1株耐Pb细菌S156-1，1株耐Pb真菌IS73-1。经鉴定S73-1菌株属于肠杆菌属(Enterobacter)细菌，S156-1为不动杆菌属(Acinetobacter)细菌，IS73-1为根霉属(Rhizopus)真菌。目前还未发现从土壤中鉴定出属于不动杆菌属和根霉属的耐重金属菌株，但鉴定出属于其他属的研究有很多。如曾奇玉 [18] 等从采矿废水湖和实验废液池中筛选出一种耐受Pb²⁺菌株，该菌株属于肠杆菌属(Enterobacter)。潘园园 [19] 从铜矿区土壤中分离筛选到一株耐Cd²⁺菌株，耐Cd²⁺浓度为2 mmol/L，经鉴定为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。蔡青云 [20] 从钨矿区铅镉污染的土壤中分离纯化得到2株对Cd²⁺具有很高耐受性的菌株，其中一株对Cd²⁺的最大耐受浓度达到1800 mg/L，经16SrDNA测序鉴定该细菌属于大肠杆菌属(Enterobacter sp.)。本次实验经筛选鉴定发现了新的耐重金属Cd和Pb微生物，为治理重金属污染土壤提供新的菌株。

试验中仅得出了肠杆(Enterobacter)菌属菌株对Cd²⁺耐受性，不动杆菌属(Acinetobacter)和根霉属(Rhizopus)对Pb²⁺具有耐受性，还未能研究它对其它重金属是否也有耐性，以一种重金属考虑其抗性还不全面，因此，今后可以对各菌株进行耐其它重金属的研究、它们最佳的除去环境条件及和植物协同作用等，通过一系列研究为治理更多的重金属污染土壤提供优质菌株。

基金项目

云南省教育厅项目(2016ZDX138)，云南省科技厅项目(2016FD089)，红河学院教学项目(YYKC181005)。

文章引用

陶宗苹,王田涛,张德刚,王传铭,施 娴. 云南省个旧市矿区耐镉和铅菌株的分离、鉴定及系统发育分析
Isolation Identification and Phylogenetic Analysis of Cd²⁺ and Pb²⁺ Tolerance Strains from Gejiu Mining Area of Yunnan[J]. 环境保护前沿, 2019, 09(03): 423-430. https://doi.org/10.12677/AEP.2019.93059

参考文献