贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳

收稿日期：2022年1月18日；录用日期：2022年3月24日；发布日期：2022年3月31日

摘要

目的：基于网络药理学和分子对接研究半夏泻心汤治疗复发性口腔溃疡的有效活性成分及分子机制。方法：利用中药系统药理学数据库(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)检索半夏泻心汤组成药物有效成分及靶点；利用Genecard数据库获取复发性口腔溃疡疾病靶点；半夏泻心汤和复发性口腔溃疡靶点分别导入Venny2.1.0获得交集基因靶点，将交集靶点导入STRING数据库构建半夏泻心汤–复发性口腔溃疡蛋白相互作用(PPI)网络；利用Cytoscape3.9.2软件绘制前8核心靶点图，分析半夏泻心汤–组成–有效成分–交集靶点–复发性口腔溃疡相互关系并进行可视化；利用DAVID数据库分析基因本体论(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集情况，采用微生信绘制GO富集柱状图，采用OmicShare Tools云工具绘制KEGG富集高级气泡图。利用分子对接技术对化合物和关键靶点的结合潜力进行验证。结果：共筛选半夏泻心汤有效成分211个及组成药物共靶点230个，复发性口腔溃疡疾病靶点4773个，交集基因靶点196个；交集靶点GO富集分析，共获得899条GO注释(P < 0.01)，其中693条与生物过程有关、67条与细胞组分有关，139条与分子功能有关；KEGG通路分析，共获得127条KEGG信号通路(P < 0.01)；根据P值大小筛选GO前10、KEGG前20分别进行可视化。结论：半夏泻心汤可能是通过有效成分11,13-Eicosadienoic acid、methyl ester、gadelaidic acid、Chrysanthemaxanthin等作用于STAT3、AKT1、TP53等关键基因靶点，参与细胞对药物的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、对乙醇的反应等生物过程，经TNF信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路等主要通路发挥作用治疗复发性口腔溃疡疾病。

关键词

半夏泻心汤，复发性口腔溃疡，网络药理学，分子对接

Study on the Mechanism of Banxia Xiexin Decoction in Treatment of Recurrent Oral Ulcers Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

Jintao He, Qi Yu^*

College of Basic Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou

Received: Jan. 18^th, 2022; accepted: Mar. 24^th, 2022; published: Mar. 31^st, 2022

ABSTRACT

Objective: To study the effective active ingredients and molecular mechanism of Banxia Xiexin Decoction in the treatment of recurrent oral ulcers based on network pharmacology and molecular docking. Methods: Use the traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform (TCMSP) to retrieve the active ingredients and targets of the constituent medicines of Banxia Xiexin Decoction; Use Genecard database to obtain disease targets for recurrent oral ulcers; Banxia Xiexin Decoction and recurrent oral ulcer targets were imported into Venny 2.1.0 to obtain the intersection gene targets, and the intersection targets were imported into the STRING database to construct the Banxia Xiexin Decoction-recurrent oral ulcer protein interaction (PPI) network; Use Cytoscape 3.9.2 software to draw the top 8 core target maps, analyze and visualize the relationship between Banxia Xiexin Decoction-composition-active ingredients-intersection target-recurrent oral ulcer; Use DAVID database to analyze gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome (KEGG) pathway enrichment, use Weishengxin to draw GO enrichment histogram and use OmicShare Tools cloud tool to draw KEGG enrichment high-level bubble charts. Molecular docking technology was used to verify the binding potential of compounds to key targets. Results: A total of 211 active ingredients of Banxia Xiexin Decoction and 230 drug targets, 4773 targets for recurrent oral ulcer disease, and 196 intersecting gene targets were screened; A total of 899 GO annotations were obtained by GO enrichment analysis of intersection targets (P < 0.01), among which 693 were related to biological processes, 67 were related to cellular components, and 139 were related to molecular functions; By KEGG pathway analysis, a total of 127 KEGG signaling pathways were obtained (P < 0.01); According to the size of the P value, the top 10 GO and the top 20 KEGG were screened for visualization. Conclusion: Banxia Xiexin Decoction may act on key gene targets such as STAT3, AKT1 and TP53 through the active ingredients 11,13-Eicosadienoic acid, methyl ester, gadelaidic acid, chrysanthemaxanthin etc., participate in cell reaction to drugs, positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription, reaction to ethanol and other biological processes, and treat recurrent oral ulcer disease through TNF signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, HIF-1 signaling pathway, and other major pathways.

Keywords:Banxia Xiexin Decoction, Recurrent Oral Ulcers, Network Pharmacology, Molecular Docking

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

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1. 引言

复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer, ROU)是临床常见的口腔黏膜病，属于慢性炎症性口腔疾病，以反复发作、单发或多发溃疡伴疼痛为特征，发病机制尚未清楚 [1]。ROU以10~30岁女性为主，呈自限性规律好转，但疼痛对饮食和言语的影响给患者生活带来了极大的痛苦，复发性也造成了严重的心理负担，目前其治疗原则主要是减少疼痛和复发率，药物包括抗生素、激素、镇痛药、贴片、漱口水、激光及中药等 [2]。研究表明，成纤维细胞增殖是促ROU的重要因素，而运用部分中药有效成分则可以有效限制成纤维细胞增殖，并通过抑制NF-κB、炎症及磷酸化AKT表达等促进口腔溃疡的愈合 [3]。中医药在治疗ROU上采取辨证分型，用经方、验方、外用方等治疗不仅获得了独特的效果，而且耐药性小、复发率低、副作用少 [4]。

经典方剂半夏泻心汤原方出自汉代张仲景的《伤寒论》，原文组成为“半夏(洗)半升，黄芩、干姜、人参、甘草(炙)各三两，黄连一两，大枣(擘)十二枚。”，是辛开苦降的代表方剂，主治脾胃寒热错杂之痞证，半夏消痞散结，黄连、黄芩苦寒泻热燥湿，干姜散寒温中，人参、大枣温中补气，甘草为使调和诸药，合理配伍发挥辛开苦降，寒热并调之功 [5]。雷雪莉认为本方病机主要为脾胃升降失司，中焦寒热错杂，临床辨证可应用于治疗慢性胃炎、消化性溃疡、消渴病、反流性食管炎、肝炎、胆囊炎、咳嗽、复发性口腔溃疡等多种疾病 [6]。项凤梅认为ROU病机属于中焦脾胃功能失常，火邪上炎，契合半夏泻心汤病机，故用于治疗ROU并取得满意效果 [7]。

半夏泻心汤有效成分复杂，目前对于其治疗ROU的作用机制尚未探明。因此，本研究借助网络药理学技术对半夏泻心汤治疗ROU的有效化学成分、靶点、通路及分子机制进行分析验证，以期为半夏泻心汤在临床上防治ROU提供一定的理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 筛选半夏泻心汤化学成分及靶点

半夏泻心汤组成药物的化学成分在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)搜索获取，筛选条件以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30% 和类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18为标准 [8]，获得半夏泻心汤的有效活性成分及靶点。

2.2. 复发性口腔溃疡疾病相关靶点的筛选

利用Genecard (https://www.genecards.org)数据库以“口腔溃疡”和“口疮”疾病为检索关键词，去掉重复值，获取复发性口腔溃疡的相关靶点。

2.3. 构建半夏泻心汤–复发性口腔溃疡蛋白相互作用(PPI)网络

运用Venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)导入半夏泻心汤和复发性口腔溃疡靶点交集信息绘制韦恩图。将药物与疾病交集靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)，选择物种“Homo sapiens”，设置medium confidence ≥ 0.900，隐藏游离基因靶点，获取PPI共靶点网络。利用Cytoscape3.9.2软件选择degree值前8为核心靶点，选择Tools工具对半夏泻心汤–组成–有效成分–靶点–复发性口腔溃疡相互关系进行分析可视化。

2.4. GO富集分析与KEGG通路预测

利用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)数据库导入半夏泻心汤–复发性口腔溃疡交集靶点进行基因本体论(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，设置(Homo sapiens)，P < 0.01。GO数据导入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)依照P值从小到大顺序筛选前10进行柱状图可视化分析，KEGG数据导入OmicShare Tools云工具(https://www.omicshare.com/tools/)依照P值从小到大顺序筛选前20进行高级气泡图可视化分析。

2.5. 化合物与潜在靶点分子对接

基于半夏泻心汤–复发性口腔溃疡蛋白相互作用网络分析结果选取排名前几的蛋白与化合物进行分子对接。半夏泻心汤有效化合物通TCMSP、PubChem进行下载，靶点STAT3 (ID: 6NJS)、AKT1 (ID: 3CQU)、TP53 (ID:1KZY)、MAPK3 (ID:6GES)的晶体结构下载于RCSB PDB (http://www.rcsb.org/)数据库。利用SYBYL-X 2.0软件将化合物能量最小化，使用“Dock Ligand”将STAT3、AKT1、TP53和MAPK3的晶体结构进行对接，通过加氢、修复侧链、选择自动处理寻找活性位点等操作取得化合物和潜在靶点之间的分子对接，并进行可视化。

3. 结果

3.1. 半夏泻心汤主要有效成分及半夏泻心汤–复发性口腔溃疡相关靶点分析

通过TCMSP数据库检索半夏泻心汤组成(半夏、黄芩、干姜、人参、甘草、黄连、大枣)，设定OB与DL值分别获得有效成分13、36、5、22、92、14、29个，获得各自对应基因靶点127、338、37、190、1247、229、344个，去除重复项，共获取190个有效成分、靶点230个。检索GeneCards数据库获得复发性口腔溃疡疾病相关靶点4773个，将疾病靶点与230个中药靶点取交集得到196个共靶点。见图1。

图1. 半夏泻心汤–复发性口腔溃疡靶点韦恩图

3.2. 构建PPI网络

将196个交集靶点导入STRING数据库进行PPI构建，网络拓扑分析获得196个节点，776条边。见图2。采用Cytoscape软件Tools工具根据degree数值大小排列，筛选前8个(JUN, STAT3, AKT1, TP53, MAPK3, RELA, MAPK1, TNF)为关键核心靶点，经拓扑分析获得8个节点，28条边，依据degree从大到小次序，颜色由深逐渐变浅，图形由大逐渐变小。见图3。

3.3. 构建半夏泻心汤–组成–活性成分–靶点–复发性口腔溃疡关系网络

将半夏泻心汤、7味组方中药、211个中药活性成分、196个交集靶点、复发性口腔溃疡导入Cytoscape进行关系分析并可视化。见图4。构建半夏泻心汤–组成–主要活性成分–前8关键核心靶点–复发性口腔溃疡网络分析。见图5。关键靶点degree值及与中药成分关系见表1。

图2. 半夏泻心汤–复发性口腔溃疡PPI网络

图3. 前8关键基因靶点

图4. 半夏泻心汤–组成-活性成分–靶点–复发性口腔溃疡关系网络

图5. 半夏泻心汤–组成–主要成分–前8关键靶点–复发性口腔溃疡关系网络

表1. 半夏泻心汤组成及活性成分与Degree前8关键基因靶点的相关分析

3.4. GO富集分析

将196个交集靶点导入DAVID数据库，设置P < 0.01共获得195个靶点的899条GO注释，其中693条与生物过程(Biological process, BP)有关、67条与细胞组分(Cellular component, CC)有关，139条与分子功能(Molecular function, MF)有关。结果显示，半夏泻心汤对复发性口腔溃疡的作用主要富集在对药物的反应(response to drug)、RNA聚合酶II启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、对乙醇的反应(response to ethanol)、老化(aging)、转录的正调控，DNA模板化(positive regulation of transcription, DNA-templated)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对雌二醇的反应(response to estradiol)、对缺氧的反应(response to hypoxia)、基因表达的正调控(positive regulation of gene expression)、对有毒物质的反应(response to toxic substance)等生物过程方面并与细胞外间隙(extracellular space)、胞质溶胶(cytosol)、膜筏(membrane raft)等细胞组分以及酶结合(enzyme binding)、蛋白质结合(protein binding)、药物结合(drug binding)等分子功能密切相关。按P值大小顺序筛选前10个GO富集靶点。见图6。

图6. 半夏泻心汤治疗复发性口腔溃疡GO富集分析柱状图

3.5. KEGG信号通路预测

交集靶点导入DAVID数据库，设置P < 0.01共获得177个靶点的127条KEGG通路，将KEGG分析数据导入OmicShare Tools云工具。结果显示，半夏泻心汤对复发性口腔溃疡的作用主要集中在乙型肝炎(Hepatitis B)、癌症途径(Pathways in cancer)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、膀胱癌(Bladder cancer)、恰加斯病(美洲锥虫病) (Chagas disease (American trypanosomiasis))、胰腺癌(Pancreatic cancer)、甲型流感(Influenza A)、弓形体病(Toxoplasmosis)、大肠癌(Colorectal cancer)、丙型肝炎(Hepatitis C)、前列腺癌(Prostate cancer)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、百日咳(Pertussis)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、癌症中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、破骨细胞分化(Osteoclast differentiation)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)、利什曼病(Leishmaniasis)、非酒精性脂肪肝(NAFLD) (Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD))等信号通路。按P值顺序选取前20个通路绘制高级气泡图。见图7。

图7. 半夏泻心汤治疗复发性口腔溃疡KEGG途径气泡图

3.6. 分子对接结果

基于半夏泻心汤–组成–活性成分–靶点–复发性口腔溃疡关系网络分析，选择相对靠前的STAT3、AKT1、TP53和MAPK3关键靶点与半夏泻心汤化合物进行分子对接验证，以评估半夏泻心汤治疗ROU的主要化合物与潜在关键靶点之间的结合潜力。结果显示Total Score > 7.8的化合物有11,13-Eicosadienoic acid, methyl ester (MOL010415)、1-Monolinolein (1-Monolinolein) (MOL002464)、(E)-3-[3,4-dihydroxy-5-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-1-(2,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (MOL004898)、gadelaidic acid (MOL004996)、Chrysanthemaxanthin (MOL004492)和Protoporphyrin (MOL000783)，将其与STAT3、AKT1、TP53和MAPK3的对接进行可视化，结果见图8。分子对接评分docking score > 5表示结合能力较好，docking score > 7时表示结合能力极好 [9]，分子对接结果总评分见图9。结果显示，半夏泻心汤的主要有效成分MOL010415、MOL002464、MOL004898、MOL004996、MOL004492和MOL000783与以上靶点结合较为紧密，可能在治疗ROU的过程中发挥着重要作用。

图8. 分子对接可视化

图9. 分子对接结合度

4. 讨论

ROU在中医属“口疮”范畴，最早见于《黄帝内经》，从中医整体观念角度认为官窍发病虽在表，实则属内在脏腑功能失调的体现，历代著名医家对其病因病机也多有阐释[9]。清·齐秉慧《齐氏医案·口疮》记载：“口疮，上焦实热，中焦虚寒，下焦阴火，各经传变所致，当分辨阴阳虚实寒热而治之。”齐文升运用三焦辨证法治疗ROU(分为上焦心火炽盛，中焦(脾虚阴火上乘、胃火炽盛上炎、中焦寒热错杂)，下焦肾水虚不治火)取得了显著疗效 [10]。中医治疗本病的优势主要是采取辨证论治为主，辨明脏腑寒热虚实分而治之。其中脾胃乃机体气机之中枢，脾主升清，胃主降浊，若其功能失调，升降失司，则运化失度，湿热内蕴，久郁化火，后循经上炎于口而发生溃疡，或使其迁延难愈。故中焦脾胃功能异常是ROU的重要病机之一。

半夏泻心汤是调节机体寒热的代表方剂，临床多应用于治疗中焦寒热错杂之证，对于ROU属此证型者也每获良效 [11]。目前认为引发ROU的病因主要包括维生素缺乏、粘膜创伤、化学物质、压力、焦虑、免疫疾病和炎症等 [12]。本研究借助网络药理学技术探讨半夏泻心汤治疗ROU的作用机制，从半夏泻心汤–组成–活性成分–关键靶点–复发性口腔溃疡关系网络获知，JUN、STAT3、AKT1、TP53、MAPK3、RELA、MAPK1、TNF等靶点及beta-sitosterol、wogonin、kaempferol、formononetin、quercetin、beta-carotene、licochalcone a、baicalein、naringenin、acacetin、isorhamnetin、ginsenoside rh2等半夏泻心汤主要化学活性成分较多的参与了此治疗过程。众所周知，炎症是许多疾病的病理基础，其在ROU发展中同样扮演着关键因素。STAT3在细胞代谢、自噬、自身免疫和炎症中起关键作用，能够在炎症反应中介导细胞因子IL-10及促炎因子TNF-α、IL-6、IL-12和IFN-γ的产生，并在Toll样受体(TLR)信号传导中起关键作用 [13]。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶B(PKB)，能够介导细胞的凋亡、增殖和转录等过程，具有促进巨噬细胞表达抗炎细胞因子的作用 [14]。TP53是一种应激反应基因蛋白，参与多种生物学过程，包括细胞周期调节、细胞分化和细胞凋亡等，并具有信号中枢的特质可以介导不同信号通路的多种靶向通路 [15]。MAPK3在调节基因表达和细胞功能中起关键作用 [16]，并可调节细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6等 [17]。于是，通过靶点调节炎症反应将是治疗ROU的一个潜在方式。

GO基因富集分析显示，半夏泻心汤主要通过对药物的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、对乙醇的反应等生物过程恢复溃疡损伤。KEGG信号通路预测显示，半夏泻心汤治疗ROU的通路主要集中在乙型肝炎、癌症途径、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等信号通路。其中TNF信号通路可参与细胞增殖、凋亡，激活NF-κB信号致使炎症发展 [18]。HIF-1信号通路可参与细胞凋亡、抗氧化应激过程，PI3K-Akt信号通路可参与细胞代谢、增殖和凋亡过程及炎症 [19]。Toll样受体信号通路可调节细胞因子IL-6和TNF-α等的释放参与炎症及免疫疾病 [20]。而半夏泻心汤主要化学成分如β-谷甾醇(beta-sitosterol)被誉为“生命之钥”，是广泛存在于天然植物中的植物甾醇，具有抑制TNF-α、IL-1β和IL-6水平，调控TLR4和核因子-kappa B (NF-κB)表达的作用 [21]。槲皮素(quercetin)是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌等活性，其可通过抑制NF-κB活化和促炎细胞因子TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-1β等的释放及促进口腔上皮细胞的增殖、迁移等对ROU起到预防和治疗的作用 [22]。山柰酚(kaempferol)是一种多酚，具有较强的抗炎作用，可通过抑制TLR4表达，降低IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α水平，增加Nrf2调节基因的mRNA表达等发挥治疗炎症疾病的作用 [23]。分子对接验证表明与关键基因靶点STAT3、AKT1、TP53等结合比较紧密的有效成分有11,13-Eicosadienoic acid, methyl ester (MOL010415)、1-Monolinolein (1-Monolinolein)、(E)-3-[3,4-dihydroxy-5-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-1-(2,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one、gadelaidic acid、Chrysanthemaxanthin和Protoporphyrin等。因此，半夏泻心汤治疗ROU可能是经多成分，多靶点，多途径共同发挥作用。

5. 总结

综上所述，中药复方治疗疾病的分子机制十分复杂，利用网络药理学技术进行网络构建、网络分析和网络验证找出关键药物成分和靶点是一种有效的方法 [24]，有利于进一步的实验研究及临床验证。

基金项目

贵州省科技创新人才团队(黔科合平台人才[2020] 5010)。

文章引用

何金涛,俞 琦. 基于网络药理学和分子对接研究半夏泻心汤治疗复发性口腔溃疡的作用机制
Study on the Mechanism of Banxia Xiexin Decoction in Treatment of Recurrent Oral Ulcers Based on Network Pharmacology and Molecular Docking[J]. 中医学, 2022, 11(02): 331-343. https://doi.org/10.12677/TCM.2022.112049

参考文献