¹新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐

²黑龙江中医药大学第一临床医学院，黑龙江 哈尔滨

³新疆医科大学乌鲁木齐市中医医院，新疆 乌鲁木齐

收稿日期：2023年11月25日；录用日期：2023年12月19日；发布日期：2023年12月29日

摘要

目的：应用网络药理学方法筛选刺山柑治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的靶点，从巨噬细胞极化途径探讨刺山柑防治类风湿关节炎的药理机制。方法：通过查阅相关文献检索刺山柑的主要化学成分；通过Pubchem有机小分子生物活性数据库检索化学成分的SMILES结构式，经Swiss ADME数据库筛选后将符合标准的化学成分上传至Swiss Target Prediction数据库预测药物活性靶点；通过人类基因数据库(Gencards)、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man, OMIM)数据库获取巨噬细胞极化相关靶点；绘制韦恩图并获取刺山柑活性成分与巨噬细胞极化的共同靶点；基于String平台构建药物疾病共同靶点的蛋白互作网络；基于David平台进行基因本体(gene ontology, GO)生物功能分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析；采用Cytoscape-v3.9.0软件构建“成分–靶点–通路”网络，应用网络分析仪(network analyzer)功能获得各成分、靶点的网络拓扑参数，筛选刺山柑发挥调控巨噬细胞极化的重要活性成分及核心靶点。结果：通过文献检索获得25个刺山柑活性成分及186个相关靶点；通过Gene Cards、OMIM数据库获得4081个巨噬细胞极化潜在靶点；将药物成分作用靶点与巨噬细胞极化相关靶点映射后，得到刺山柑调控巨噬细胞极化治疗RA的靶点165个；GO生物功能富集分析得到681个条目，其中生物过程445条，细胞组分74条，分子功能162条；KEGG通路富集分析获得136个信号通路，主要涉及HIF-1信号通路、氮素代谢通路、ROS通路、PI3K-Akt信号通路等生物学途径；网络拓扑分析得出刺山柑调控巨噬细胞极化的重要活性成分异鼠李素、木犀草素、山柰酚、芹菜素等化合物，重要靶点基因主要有AKT1、TNF、EGFR等。结论：刺山柑可能通过异鼠李素、山奈酚、木犀草素、芹菜素等潜在药效成分调控AKT1、TNF、EGFR等多个靶点基因的表达，通过HIF-1信号通路、氮素代谢通路、ROS通路、PI3K-Akt信号通路等多个信号通路协同作用，发挥调控巨噬细胞极化介导RA治疗的作用。

关键词

刺山柑，巨噬细胞极化，类风湿关节炎，网络药理学

Study on the Mechanism of Uygur Medicine Capparis spinosa in Treating RA from Macrophage Olarization Pathway Based on Network Pharmacology

Yongfeng Liu¹, Xin Liu^1*, Yongshou Liu², Ruixue Bi³

¹Institute of TCM, Xinjiang Medical University, Urumqi Xinjiang

²The First Clinical College of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang

³Urumqi Hospital of TCM, Xinjiang Medical University, Urumqi Xinjiang

Received: Nov. 25^th, 2023; accepted: Dec. 19^th, 2023; published: Dec. 29^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To investigate the mechanism of treatment of rheumatoid arthritis (RA) with macrophage polarization pathway of capers based on network pharmacology. Methods: The main chemical constituents of capers were retrieved by referring to relevant literature. SMILES structural expressions of chemical components were retrieved through Pubchem organic small molecule bioactivity database, and chemical components meeting the criteria were screened by Swiss ADME database and uploaded to Swiss Target Prediction Database for drug active targets prediction. Targets related to macrophage polarization were obtained from the Human Gene Database (Gencards) and the online mendelian inheritance in man (OMIM) database. The common target of active components of capers and macrophage polarization was obtained by Wynn diagram. The protein interaction network of common target of drug disease was constructed based on String platform. The biological functions were analyzed based on the gene ontology (GO) platform and the enrichment analysis of the kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway was conducted based on the David platform. Cytoscape-v3.9.0 software was used to construct the “component-target-pathway” network, network topology parameters of each component and target were obtained by network analyzer, and important active components and core targets of Capers were selected to play a role in regulating macrophage polarization. Results: 25 active ingredients and 186 related targets of capers were obtained by literature search. A total of 4081 potential targets for macrophage polarization were obtained by Gene Cards and OMIM database. After mapping the targets of drug components to the targets related to macrophage polarization, 165 targets of capers regulating macrophage polarization for RA treatment were obtained. GO biological function enrichment analysis obtained 681 items, including 445 biological processes, 74 cell components, and 162 molecular functions. KEGG pathway enrichment analysis obtained 136 signaling pathways, mainly involving HIF-1 signaling pathway, nitrogen metabolism pathway, ROS pathway, PI3K-Akt signaling pathway and other biological pathways. Network topology analysis showed that isorhamnetin, luteolin, kaempferol, apigenin and other important active components of capers regulate the polarization of macrophages, and the important target genes were mainly AKT1, TNF, EGFR and so on. Conclusions: Capers may regulate the expression of AKT1, TNF, EGFR and other target genes through potential pharmacodynamic components such as isorhamnetin, kaempferol, luteolin and apigenin, and through the synergistic effect of HIF-1 signaling pathway, nitrogen metabolism pathway, ROS pathway, PI3K-Akt signaling pathway and other signaling pathways. Play a role in regulating macrophage polarization mediating RA therapy.

Keywords:Capparis spinosa, Macrophage Polarization, Rheumatoid Arthritis, Network Pharmacology

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

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1. 引言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种病因未明的进行性、系统性自身免疫疾病，其基础的病理改变为关节滑膜炎症、血管翳形成，并逐渐出现关节软骨和骨的破坏，导致关节畸形和功能障碍 [1] 。在我国RA患病率已达到0.42%，并呈现不断升高趋势，病程为5~10年患者致残率为43.48% [2] ，既造成患者自身生活质量减低，而且长期的医疗和康护费用形成严重的经济困境。RA炎症过程中涉及固有免疫系统的ILCs亚群和适应性免疫系统的细胞失衡以及细胞因子调节失调等不同途径 [3] 。巨噬细胞是固有免疫系统重要成员，不仅可以吞噬和杀灭致病微生物，还能通过生产多种促炎细胞因子和趋化因子参与RA致病过程。在不同的微环境影响下，巨噬细胞可极化为不同的亚型，发挥促炎和抗炎的不同作用 [4] ，这一生物学过程被称为巨噬细胞极化 [5] 。根据功能及炎症因子分泌水平分，可将其分为两种表型：一种为脂多糖(lipoplysaccharides, LPS)和(或)干扰素(interferon, IFN)-γ等促炎因子诱导的经典活化巨噬细胞，即M1型巨噬细胞，分泌促炎介质TNF-α、IL-12、IL-6，活性氧(reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(nitricoxide, NO)等。第二种为IL-4、IL-13、IL-10和TGF-β等诱导的抗炎巨噬细胞，既M2型巨噬细胞，可分泌TGF-β、VEGF、EGF等因子，具有促进组织修复、血管再生及纤维化的功能 [6] 。M1和M2极化失衡是RA重要病理变化之一。在RA患者中，M1/Th1激活发生在toll样受体(TLR)和干扰素(IFN)信号主导的炎症环境中，它促进肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-1、IL-12、IL-18和IFNγ、趋化因子和基质金属蛋白酶的大量产生，导致破骨细胞形成、侵蚀和进行性关节破坏。另一方面，M2/Th2反应的激活决定了抗炎过程中生长因子和细胞因子的释放，从而导致RA的临床缓解 [7] 。

刺山柑(Capparis spinosa L.)为白花菜科山柑属藤本植物，《新疆药用植物志》记载其有祛风除湿、散寒、止痛、消肿等功效 [8] [9] ，为新疆地区维吾尔医治疗风湿病习用药材，近年来，许多学者对刺山柑在抗风湿方面的作用进行了研究，周海凤 [10] 等动物实验发现刺山柑精制提取物，能有效缓解弗氏完全佐剂和II型胶原引起的大鼠关节附件的肿胀，其作用机制可能是通过下调TNF-α、IL-1、IFN-α等相关炎症因子的表达。古丽娜 [11] 等发现刺山柑凝胶能够下调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-17和上调抑炎因子IL-10表达水平，达到缓解类风湿关节炎症状、缩短病程及治疗疾病的作用。上述研究表明，刺山柑治疗RA机制可能是调控巨噬细胞极化通路，但具体作用机制尚不明确。

网络药理学是一种通过构建“药物–疾病–靶点”多级网络，揭示药物与疾病关联，进而在蛋白质、分子和基因水平上阐释药物对疾病作用机制 [12] 的生物信息学系统研究方法。本研究采用网络药理学方法，获取维药刺山柑的主要活性成分，从巨噬细胞极化途径揭示维药刺山柑调控RA的机制，为刺山柑的临床应用及科学研究提供参考。

2. 资料与方法

2.1. 刺山柑活性成分及作用靶点的收集

查询相关文献 [13] [14] [15] 获取刺山柑化学成分，并将化学成分名称输入Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)依次进行检索，获取化学成分的SMILES结构式，借助Swiss ADME数据库(http://www.swissadme.ch/)，进一步筛选刺山柑疗效较完善的活性化合物。将筛选所得数据导入Swiss Target Prediction平台 [16] ，筛选出置信度(probability) ≥ 0.1的靶点，并在蛋白质序列数据库(https://www.uniprot.org/) [17] ，进行靶点蛋白名称标准化处理，整合药物相关靶点。

2.2. 巨噬细胞极化相关靶点的收集

基于人类孟德尔遗传数据库(https://www.omim.org/) [18] 、人类基因数据库(https://www.genecards.org/) [19] 进行检索，以“Macrophage polarization”作为检索词，整合去重，获取巨噬细胞极化的潜在靶点数据。

2.3. 刺山柑活性成分–巨噬细胞极化共同靶点的获取及蛋白相互作用网络 (Protein Protein Interaction, PPI)的构建

将刺山柑活性成分相关靶点及巨噬细胞极化靶点输入Venny 2.1网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)建立数据库，筛选交集靶点，绘制韦恩图(Venn diagram)。

随后利用String平台(https://cn.string-db.org/) [20] 预测“刺山柑活性成分–巨噬细胞极化”靶点相互作用关系，设定物种为智人(Homo sapiens)，最小互相作用阈值为“highest confidence (>0.9)”，其他参数保持默认设置，获取PPI数据网络。

2.4. 富集分析

将刺山柑作用于巨噬细胞极化的靶点信息上传至David (https://david.ncifcrf.gov/) [21] 数据库，分别进行GO基因本体生物功能分析和KEGG通路富集分析，设置P < 0.01，结果应用在线绘图系统Hiplot (https://hiplot-academic.com/)进行数据可视化，选取前10个条目绘制富集分析图。

2.5. “药物成分–靶点–信号通路”网络的构建

将药物成分和靶点信息导入Cytoscape-v3.9.0软件，构建“药物成分–靶点–信号通路”的模式图，并使用网络分析仪(network analyzer)插件获得各成分、靶点的网络拓扑参数，获得刺山柑调控巨噬细胞极化的重要活性成分及核心靶点。

3. 结果

3.1. 刺山柑活性成分及其相关靶点

通过文献检索获得刺山柑化学成分，经Swiss ADME数据库，根据5类药性预测(egan, Lipinski, veber, ghose, muegge)结果中有2个及2个以上“YES”作为筛选条件，最终获得阿魏酸、芹菜素、山奈酚等25个刺山柑活性成分(见表1)。通过将SMILES结构式上传至Swiss Target Prediction数据库，预测得到药物作用靶点，合并去重，共得到刺山柑活性成分相关靶点186个。

3.2. 巨噬细胞极化相关靶点

以“Macrophage polarization”作为检索词作为关键词，在GeneCards数据库检索得到3930个巨噬细胞极化的潜在靶点，OMIM数据库中获得151个巨噬细胞极化的潜在靶点。去除重复靶点后，将潜在靶点在Uniprot数据库进行基因名称规范，共获得4081个潜在靶点。

3.3. “药物–疾病”共同靶点及PPI网络

应用Venny 2.1网站将186个刺山柑活性成分靶点与4081个巨噬细胞极化相关靶点进行映射，最终得到“药物–疾病”共有靶点165个，并绘制Venn图(见图1)。将获得的165个“药物–疾病”共有靶点上传至String数据库，构建PPI网络，该网络包含165个相互作用节点和1210条相互作用关系(见图2)。

表1. 刺山柑活性成分

图1. 药物靶点与疾病靶点韦恩分析图

图2. PPI网络图

3.4. GO生物功能和KEGG通路富集分析

将165个“药物–疾病”共有靶点导入David平台，进行GO生物功能分析和KEGG通路富集分析，包括生物过程(biological processes, BP)、细胞组分(cellular components, CC)、分子功能(molecular functions, MF)，以P < 0.01为主要筛选标准，获得GO生物功能条目681条，其中BP445条，主要涉及蛋白激酶B信号传导的正向调节(positive regulation of protein kinase B signaling)、蛋白质磷酸化(protein autophosphorylation)、对药物的反应(response to drug)、单碳代谢过程(one-carbon metabolic process)；CC79条，主要涉及质膜(plasma membrane)、胞浆(cytosol)、细胞质(cytoplasm)、细胞外外泌体(cytoplasm)、大分子复合物(macromolecular complex)等；MF154条，主要涉及水解酶活性(hydro-lyase activity)、碳酸盐脱水酶活性(carbonate dehydratase activity)、酶结合(enzyme binding)、ATP结合(ATP binding)等(见图3)。

图3. GO生物功能分析柱状图

KEGG分析共获得136个信号通路，主要涉及缺氧诱导因子通路(HIF-1signaling pathway)、活性氧致癌(chemical carcinogenesis-reactive oxygen species)、氮代谢(nitrogen metabolism)、PI3k-AKT信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌症通路(Pathways in cancer)等(见图4)。

3.5. “药物成分–靶点–通路”网络的构建

应用Cytoscape-v3.9.0软件构建“药物成分–靶点–通路”可视化模式图，共见200个节点，724个相互关系(见图5)。借助网络分析(network analyzer)功能进行网络拓扑分析，degree度值度值越高，表示参与的生物过程越多，获得度值最高的四种核心有效成分，分别是异鼠李素、山奈酚、芹菜素、木犀草素。主要靶点基因，degree度值最高前四依次为AKT1、TNF、EGFR、SRC。

图4. KEGG通路分析图

图5. “药物成分–靶点–通路”网络

4. 讨论

现代医学研究表明巨噬细胞极化参与RA的滑膜炎症和骨侵蚀，并与RA疾病活动密切相关 [22] 。同时有研究表明刺山柑对巨噬细胞极化相关因子具有调节作用。本研究采用网络药理学方法从巨噬细胞极化途径探讨分析了刺山柑治RA的潜在作用机制。共挖掘出刺山柑成分25个，药物潜在靶点186个，巨噬细胞极化相关靶点4081个，“药物–疾病”共同靶点165个。

本研究发现在“药物成分–靶点–通路”网络中异鼠李素(isorhamnetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、芹菜素(celery)等黄酮化合物自由度最高。已有研究发现，这4种成分对巨噬细胞极化平衡具有调控作用，发挥显著的抗炎活性。异鼠李素对LPS所介导的促炎性因子释放具有一定抑制作用，陈伟明 [23] 等通过用ELISA法检测细胞炎症因子释放，证实异鼠李素能减弱LPS刺激下THP-1细胞IL-6、TNF-α、MCP-1等炎症因子的释放，并与作用浓度相关。山柰酚被证实能够抑制高糖和LPS诱导巨噬细胞产生的NO及IL-1β，诱导巨噬细胞向M2型转化 [24] 。动物实验研究结果证实对改善CIA模型小鼠关节水肿、调节炎症细胞迁移、软骨改变和骨侵蚀 [25] 产生作用。有研究发现，木犀草素可能通过参与下调p-STAT3及上调p-STAT6来调节RAW264.7细胞极化，既抑制M1型巨噬细胞标志物的表达，并促进M2型标志物的表达 [26] 。郑梦菲 [27] 等用100 ng/mLLPS刺激RAW264.7巨噬细胞构建炎症模型，发现木犀草素和芹菜素可以抑制模型中巨噬细胞NF-κB信号通路的激活，调控巨噬细胞极化。以上研究提示，异鼠李素、山奈酚、木犀草素、芹菜素等成分可能是刺山柑调控巨噬细胞极化治疗RA的重要活性成分，参与抑制炎症和免疫反应进而发挥治疗作用。

KEGG通路富集分析发现刺山柑主要通过调控HIF-1信号通路、氮素代谢通路、ROS通路、PI3K-Akt信号通路等生物学途径调节巨噬细胞极化平衡发挥抑制炎症和免疫反应、调节骨代谢的作用。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)，是组织细胞在低氧状态下诱生最直接的唯一调控因子，由氧依赖性的功能亚单位α亚基(包括1α、2α、3α)和结构亚单位β亚基构成 [28] [29] 。

巨噬细胞极化常伴随着代谢水平的变化。M1型巨噬细胞以糖酵解为主要途径获取能量。研究表明HIF-1α通过直接反式激活编码丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1)的基因，PDK1使丙酮酸脱氢酶失活，丙酮酸无法转化为乙酰辅酶A，导致丙酮酸在三羧酸循环中无法被进一步代谢，三羧酸循环循环受到抑制。并将葡萄糖代谢物从线粒体分流到糖酵解，诱导巨噬细胞M1型极化 [30] [31] 。与此同时，细胞氧化呼吸链减弱，在6-磷酸果糖-2激酶(6-phosphofructo-2-kinase, PFK2)催化作用下，活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)生成增多，ROS与NO产生协同效应，从而促使巨噬细胞分泌促炎因子，介导巨噬细胞M1型极化 [32] 。潘书涵 [33] 等的研究也表明人RA-FLS细胞培养液与细胞中TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO等巨噬细胞极化诱导因子均会逐渐增加。

PI3K可将磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)磷酸化成磷酸酰肌醇3磷酸(PIP3)。多种生长因子和细胞因子等都能通过激活PI3K活化PI3K/AKT通路，进而引起级联反应。AKT是一种特异性蛋白激酶，参与了PI3K信号的许多下游活动，同时还扮演着PI3K/AKT通路传导信使的重要角色，AKT被活化后可调控细胞存活、增殖和凋亡的蛋白靶点 [34] 。研究显示PI3K/Akt信号通路在巨噬细胞激活和基因表达中发挥至关重要的作用，Akt激酶参与巨噬细胞极化调控，敲除Akt1基因引起M1极化，相反，敲除Akt2则引起M2极化 [35] [36] 。有文献报道，PI3K被激活后导致趋化因子SDF-1表达增加，造成破骨细胞OC前体细胞数量增加、迁移增强，启动RA骨破坏 [37] 。此外，关键靶点还富集在类固醇激素生物合成信号通路、黄体酮介导的卵母细胞成熟通路、癌症通路，提示刺山柑对性激素分泌、癌症等亦有调控作用。

PPI网络拓扑分析可知，刺山柑调控巨噬细胞极化的主要靶点为TNF、AKT1、EGFR等。TNF家族包括TNF-α和TNF-β，研究表明TNF-α诱导的滑膜炎症反应是RA发病中重要的原因之一。此外还调控IL-1、IL-6和MMPs等炎症因子的释放，激活破骨细胞分泌蛋白酶消化骨基质，是骨质破坏的重要机制 [38] 。TNF-α抑制剂为临床常用生物制剂，可通过阻断TNF-α与受体结合，已经成为治疗RA的有效策略 [39] 。AKT1是PI3K/Akt通路的重要一员，该通路参与调节细胞周期、控制凋亡等诸多方面、血管形成等病理生理过程 [40] 。RA患者滑膜中EGFR基因所表达的AP-1蛋白水平的升高将增加IL-6的产生，促进滑膜成纤维细胞增殖 [41] 。

5. 结语

本文采用网络药理学为研究方法，构建“刺山柑有效成分–靶点–巨噬细胞极化”网络模式图，分析了有效成分–靶点–信号通路之间的相互作用关系，并推测维药刺山柑可能通过异鼠李素、山奈酚、木犀草素、芹菜素等潜在药效成分协同作用于AKT1、TNF、EGFR等多个靶点，通过HIF-1信号通路、氮素代谢通路、ROS通路、PI3K-Akt等多个信号通路协同作用，初步揭示了刺山柑调控巨噬细胞极化治疗RA的作用机制，为药效物质基础提供了参考依据，对于未来更深入的机制研究具有一定的参考价值，同时刺山柑调控巨噬细胞极化治疗RA的具体生物学机制有待更进一步的实验论证。

基金项目

国家自然科学基金(项目编号：81860834)。

文章引用

刘永丰,刘 新,刘永寿,毕瑞雪. 基于网络药理学从巨噬细胞极化途径研究维药刺山柑治疗RA的作用机制
Study on the Mechanism of Uygur Medicine Capparis spinosa in Treating RA from Macrophage Olarization Pathway Based on Network Pharmacology[J]. 临床医学进展, 2023, 13(12): 20607-20618. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.13122898

参考文献