ABSTRACT

The optimized fermentation medium was obtained by PB design and orthogonal experimental design. Based on fermentation condition in 50L biological reactor, the experiment was scaled up into 400 L fermentor on the basis of same KLa. The results indicated that the living bacteria count of Bacillus amyloliquefaciens was mainly influenced by (NH₄)₂SO₄, cornmeal, corn steep liquor and glucose. The obtained fermentation medium was as follows cornmeal 8 g/L, glucose 12 g/L, (NH₄)₂SO₄ 0.8 g/L, and corn steep liquor 7 g/L. The fermentation condition of 50 L biological reactor was as follows the temperature 30˚C, the inoculation rate 1%, the speed 200 r/min in 0 - 8 hours and 250 r/min after 8 hours, the ventilation quantity 15 - 40 L/min and the fermentation time about 30 hours. The fermentation condition of 400L biological reactor was as follows the temperature 30˚C, the speed 130 r/min in 0 - 8 hours and 160 r/min after 8 hours, the ventilation quantity 9 - 15 m³/h and the fermentation time about 30 hours. Under the condition, the living bacteria count was 2.5 × 10⁹/mL.

Keywords:Bacillus amyloliquefaciens, PB Design, Orthogonal Experimental Design, Scale-Up Technology

解淀粉芽孢杆菌的培养基优化和放大研究

严国富^*，赵从波，杨攀科，汤洁

北京雷力海洋生物新产业股份有限公司，北京

收稿日期：2018年9月3日；录用日期：2018年9月14日；发布日期：2018年9月21日

摘 要

采用PB设计和正交试验设计优化解淀粉芽孢杆菌发酵培养基，在50L发酵罐发酵条件基础上采用以体积溶氧系数为基准的放大法进行了比拟放大。结果表明，(NH₄)₂SO₄、玉米粉、玉米浆和葡萄糖的质量浓度是影响有效活菌数的主要因素，最优组合为玉米粉8 g/L、葡萄糖12 g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.8 g/L、玉米浆7 g/L；50 L发酵罐发酵条件：温度30℃，接种量1%，搅拌转速0~8小时200 r/min，8小时后250 r/min，通风量15~40 L/min，发酵周期30小时，放大罐的发酵工艺：温度30℃，搅拌转速0~8小时130 r/min，8小时后160 r/min，通风量9~15 m³/h，有效活菌数为2.5 × 10⁹/mL。

关键词 :解淀粉芽孢杆菌，PB设计，正交设计，比拟放大

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1. 引言

解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，具有抑制植物病害的能力，能够产生多种代谢产物，主要包括：抑菌蛋白类，脂肽类蛋白质，伊枯草菌素A，表面活性物质，芬芥素，芽孢菌素D，大环内酯类，寡肽酶，肽类，聚酮化合物等 [1] - [6] 。解淀粉芽孢杆菌对多种作物的致病真菌有较好的抑制效果，可制成生物制剂应用于植物病害防治上，因此其发酵工艺和比拟放大的研究具有非常重要的意义。实验室分离的解淀粉芽孢杆菌(保藏号：CGMCC5043，专利号：ZL201210293465)能够降低灰霉病、立枯病、根腐病和炭疽病等多种农作物病害的发病指数。本实验能过PB设计和正交试验设计优化了菌株的培养基，同时在50 L发酵罐中进行了扩大培养，并采用以体积溶氧系数为基准的放大法进行了比拟放大，为下一步工业化生产提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 菌株

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，由北京雷力集团技术研发中心保藏。

2.1.2. 培养基

斜面培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，葡萄糖5，酵母粉5，琼脂20。

液体种子培养基(g/L)：玉米淀粉10，蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5。

初始发酵培养基(g/L)：玉米粉12，豆饼粉18，CaCO₃ 5，葡萄糖8，(NH₄)₂SO₄ 1，玉米浆5，MgSO₄ 2，MnSO₄ 0.5。

2.2. 方法

2.2.1. 培养条件

菌种活化：将保藏于斜面的菌株转接到斜面培养基上，30℃培养24小时，4℃保存备用。

液体种子液制备：试管斜面中加10 mL无菌水，刮下菌体，倒入90 mL无菌水中，摇床振荡30分钟，制备成菌悬液。取30 mL种子培养基于150 mL三角瓶中，灭菌。接种菌悬液1 mL，置于摇床中培养15~18小时，培养温度30℃，转速200 r/min。

摇瓶发酵培养：取30 mL发酵培养基于150 mL三角瓶中，灭菌，接种0.3 mL种子液，置于摇床中培养28~32小时，培养温度30℃，转速220 r/min。

2.2.2. 测定方法

比浊法：发酵液1000 r/min离心10分钟，上清液稀释至一定倍数，用721分光光度计(波长600 nm)测定发酵液，以蒸馏水做对照。以光密度值OD₆₀₀为标准判断菌数。

菌落计数：执行国家标准GB 20287-2006。

2.2.3. PB (Plackett-Burman)设计

PB设计法是一种两水平的试验设计方法，它可以用最少的试验次数使各因素的主效应得到尽可能精确的估计，从众多考察因素中快速筛选出最为重要的几个因素。选用实验次数N = 12的设计，对初始培养基中的8种成分进行二水平设计，从中选出对解淀粉芽孢杆菌有效活菌数影响较大的因素 [7] [8] 。

实验选用次数N = 12的设计，培养基中的8种成分：玉米粉，豆饼粉，CaCO₃，葡萄糖，(NH₄)₂SO₄，玉米浆，MgSO₄，MnSO₄，分别作为PB设计中的8个因素，每个因素取两个水平，低水平“−1”为原始培养条件，高水平“1”取低水平的1.25倍，PB设计实验水平及编码见表1。

2.2.4. 正交试验

根据PB设计试验结果，选择对解淀粉芽孢杆菌有效活菌数影响较大的4个因素，并确定试验水平，采用L₉(3⁴)正交表进行四因素三水平正交试验优化培养基配方，每个处理设3次重复。

2.2.5. 发酵罐放大

在摇瓶发酵的基础上，进行了50 L发酵罐放大，发酵条件：装料系数0.6，温度30℃，接种量1%，压力0.05 MPa，搅拌转速250 r/min，pH值自然，通风量15~40 L/min。在50 L发酵罐基础上，根据Kla (体积溶氧系数)相同的原则进行发酵罐放大。

根据公式计算KLa；

${\text{P}}_0＝{\left(\text{N}/\text{6}0\right)}^{\text{3}}{\text{D}}^{\text{5}}\rho {\text{N}}_{\text{p}}\times \text{2}\times \text{1}{0}^{-\text{3}}$

${\text{P}}_{\text{g}}＝\text{2}.\text{25}\times \text{1}{0}^{-\text{3}}{\left(\frac{p_0^{2}N{D}^3}{Q^{0.08}}\right)}^{0.39}$

${\text{k}}_{\text{d}}=\left(\text{2}.\text{26}+\text{3}.{\text{3N}}_{\text{i}}\right){\left(\text{Pg}/\text{V}\right)}^{0.\text{56}}{\upsilon }_s^{0.7}{\text{N}}^{0.\text{7}}\times \text{1}{0}^{-\text{9}}$

P₀——无通气时搅拌器输入液体的功率(千瓦)

N——涡轮搅拌器转速(转/分)

D——搅拌器直径(米)

ρ——发酵液密度(公斤/米³)

N_p——功率准数，试验罐和放大罐均为2档圆盘六平直叶涡轮，取常数6

P_g——通气时搅拌器输入液体的功率(瓦)

Q——通气量(毫升/分)

k_d——溶氧系数( $\left[\frac{摩尔氧}{毫升\cdot 分\cdot 大气压\left(p\right)}\right]$ )

N_i——涡轮个数

V——发酵液体积(米³)

υ_s——发酵罐空截面空气线速度(厘米/分)

3. 结果分析

3.1. PB设计筛选主要因素

数据分析采用Mintab 17软件进行，响应值(Y)为有效活菌数。实验设计及结果如表2所示，各因素效应及评价表如表3所示。

由PB设计结果得出回归方程： $\text{Y}=\text{17}.\text{625}-\text{1}.\text{675}\times \text{1}+0.\text{442}\times \text{2}-0.\text{325}\times \text{3}+0.\text{675}\times \text{4}-\text{1}.\text{775}\times \text{5}+\text{1}.\text{442}\times \text{6}-0.\text{158}\times \text{7}+0.\text{392}\times \text{8}$ 。(NH₄)₂SO₄、玉米粉、玉米浆和葡萄糖对有效活菌数的影响较大，其中(NH₄)₂SO₄和玉米粉为负效应，降低浓度可提高活菌数，玉米浆和葡萄糖为正效应，提高浓度可提高活菌数。

表1. PB设计实验设计水平及编码

表2. PB设计实验设计及结果

表3. PB设计实验各因素效应及评价表

3.2. 正交试验优化培养基

根据PB试验的筛选结果，(NH₄)₂SO₄、玉米粉、玉米浆和葡萄糖4个因素对有效活菌数影响较大，采用L₉(3⁴)正交表设计了四因素三水平正交试验，每个处理设3次重复。正交试验设计各因子和水平见表4，正交试验设计及结果见表5。

由表5可知，最优培养基组合为A1B2C2D2，即玉米粉8 g/L，葡萄糖12 g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.8 g/L，玉米浆7 g/L，根据极差(R)大小分析可知，4因素对有效活菌数影响主次顺序为玉米粉 > (NH₄)₂SO₄ > 玉米浆 > 葡萄糖。最优组合与实验2相同，无须再做验证实验，优化培养基有效活菌数为33.77亿/mL。

3.3. 发酵罐放大

在前期工作的基础上，确定了50 L发酵罐发酵条件：装料系数0.6，温度30℃，接种量1%，压力0.05 MPa，搅拌转速0~8小时200 r/min，8小时后250 r/min，通风量15~40 L/min，pH值自然，发酵周期30小时(图1)。

发酵8小时后，溶氧开始急速下降，表明菌体生长速度很快，此时调节搅拌转速和风量，提高溶氧，发酵16小时后，溶氧降至最低点，20小时后，溶氧开始回升，表明菌体繁殖速度减缓，27小时，溶氧上升速度减缓，芽孢大量形成，发酵30小时，芽孢率达到95%，发酵结束，平板计数30亿/mL (图2)。

从50 L发酵罐发酵情况看，发酵8小时后，溶氧下降速度非常快，说明菌体耗氧速度快，因此，在发酵罐放大过程中采用以体积溶氧系数为基准的放大法。试验罐与放大罐基本参数对照见表6，试验罐与放大罐放大工艺参数见表7。

根据小罐发酵情况，为避免泡沫过大，造成逃液，放大罐空截面空气线速度取90 cm/min，通风量

$\text{Q}=\frac{\text{π}}{4}\times {\text{32}}^{\text{2}}\times \text{9}0=\text{2}.\text{54}\times \text{1}{0}^{\text{5}}\left(\text{mL}/\text{min}\right)$ ，约等于1.06 vvm。

计算得溶氧系数为2.83 × 10⁻⁶，依据溶氧系数相等原则可计算出放大罐搅拌转速为159.2 r/min，取整数为160 r/min。由此确定了放大罐发酵工艺参数：温度30℃，搅拌转速0~8小时130 r/min，8小时后160 r/min，通风量9~15 m³/h。

在放大罐上做了发酵试验，每2小时测定发酵OD值，结果见图3。

从图3可以看出，发酵24小时OD值达到最大值，取样镜检，无芽孢，发酵30小时后，芽孢率达到95%，停止发酵。平板计数有效活菌数为25亿/mL，接近小罐水平。

表4. 正交试验各因素及水平表

表5. 正交实验设计及结果

图1. pH值随时间变化曲线

图2. 溶氧随时间变化曲线

图3. 发酵液OD值变化曲线

表6. 试验罐与放大罐基本结构参数对照表

表7. 试验罐与放大罐放大工艺参数对照表

4. 结论

通过PB设计筛选出了对解淀粉芽孢杆菌有效活菌数影响较大的4个主要因素：(NH₄)₂SO₄、玉米粉、玉米浆和葡萄糖，其中(NH₄)₂SO₄和玉米粉为负效应，玉米浆和葡萄糖为正效应。对以上4个因素做了4因素3水平的正交试验，确定了最优培养基组合为玉米粉8 g/L、葡萄糖12 g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.8 g/L、玉米浆7 g/L，摇瓶发酵有效活菌数为33.77亿/mL。

确定了50 L发酵罐发酵条件：装料系数0.6，温度30℃，接种量1%，压力0.05 MPa，搅拌转速0~8小时200 r/min，8小时后250 r/min，通风量15~40 L/min，pH值自然，发酵周期30小时，有效活菌数为30亿/mL。在50 L发酵罐基础上进行了放大试验，放大倍数为8倍，采用以体积溶氧系数为基准的放大法确定了400 L发酵罐的发酵工艺：温度30℃，搅拌转速0~8小时130 r/min，8小时后160 r/min，通风量9~15 m³/h，有效活菌数为25亿/mL，接近小罐水平。以体积溶氧系数为基准的放大法在解淀粉芽孢杆菌放大过程中是可行的，为解淀粉芽孢杆菌的工业化生产提供了理论依据。

文章引用

严国富,赵从波,杨攀科,汤 洁. 解淀粉芽孢杆菌的培养基优化和放大研究
Research on the Optimization of Fermentation Medium and Scale-Up Technology of Bacillus amyloliquefaciens[J]. 微生物前沿, 2018, 07(03): 107-114. https://doi.org/10.12677/AMB.2018.73013

参考文献