¹青海大学研究生院，青海 西宁

²青海省第四人民医院呼吸科，青海 西宁

收稿日期：2023年5月7日；录用日期：2023年5月31日；发布日期：2023年6月9日

摘要

随着耐药结核病的流行，结核病的防治形势非常严峻。高分辨率熔解曲线检测技术(high-resolution melting analysis, HRM)，在诊断率较高的基础上，有助于缩短患者等待的时间，并且使耐药肺结核治疗方案更加优化，在降低疾病传播中起到重要的作用。本文将对HRM技术检测结核分枝杆菌的应用作一综述。

关键词

高分辨率熔解曲线，结核分枝杆菌，耐药性

Application of High-Resolution Melting Curve in the Detection of Mycobacterium tuberculosis

Bingqian Xie¹, Yuqing Wang^2*

¹Graduate School of Qinghai University, Xining Qinghai

²Respiratory Department, The Fourth People’s Hospital of Qinghai Province, Xining Qinghai

Received: May 7^th, 2023; accepted: May 31^st, 2023; published: Jun. 9^th, 2023

ABSTRACT

With the prevalence of drug-resistant tuberculosis, situation of drug-resistant tuberculosis control is very serious. Based on the high diagnostic rate, high-resolution melting analysis detection technology can help shorten the waiting time of patients and optimize the treatment plan of drug-resistant tuberculosis, which plays an important role in reducing the spread of the disease. This article will review the application of HRM in the detection of Mycobacterium tuberculosis.

Keywords:High-Resolution Melting Curve, Mycobacterium tuberculosis, Drug Resistant

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1. 引言

结核病(TB)具有传播性并可通过空气传播，是全球第13大死因。它既是艾滋病毒感染者的主要杀手，也是抗菌素耐药导致死亡的主要原因。据WHO报道，2021年全球新发结核病患者1060万人，耐药结核病负担较2020年也有所增加，中国是结核患者占全球总数的2/3以上的国家之一，使用世界卫生组织推荐的快速分子诊断技术，使得患者得到早期和诊断准确是“终结结核病流行策略”下强化实验室能力的三个主要内容之一 [1] 。快速诊断技术的推广仍然缓慢，在2021年新诊断的640万结核病患者中，只有38%是快速分子诊断技术所诊断的，因此，加快推广快速分子诊断技术，及时而准确地提供病原菌药敏结果对于正确给药、控制病原菌耐药以及挽救病人生命具有重要的意义。HRM技术从基因的角度出发，在菌种鉴定和耐药性检测上都更直接地反映待测标本的菌株信息，该检测方法因检测速度快、特异度高而引起了广泛关注 [2] ，本文就其在结核分枝杆菌检测中的应用进行描述。

2. HRM技术介绍

HRM技术是2002年美国爱德华科技公司与美国犹他大学Carl Wittwer实验室合作开发的一种基因序列分析的新技术 [3] ，该技术操作容易，成本较低，在密闭的环境中检测，生物安全性高，检测时间短；灵敏度、特异度高 [4] ，现已广泛用于医学、遗传学、微生物学、动植物学、法医学和农业等学科。HRM技术的应用领域主要在单核苷酸多态性(aingle nucleotide polymorphism)分析、基因分型、甲基化分析、突变扫描、序列匹配等方面 [5] 。其实质是在实时荧光定量PCR (RT-PCR)的基础上，将饱和染料加入，在PCR反应扩增完后直接通过高分辨熔解分析仪进行熔解分析，从而得到结果。

技术原理

HRM技术是PCR扩增技术与熔解曲线分析技术相结合，建立在核酸分子的物理性质不同的基础上，实时升高温度监测DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，通过仪器检测扩增子中饱和荧光染料的荧光强度变化，获得特征性熔解曲线。当温度升高时，双链DNA离解成单链，此时荧光染料解离下来，导致荧光强度开始逐渐降低。最初下降的速度较缓慢，当达到某一特定温度时，信号强度迅速降低，这一温度就是熔解温度，即Tm值，Tm值下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关，据此可以区分和检测突变型和野生。这是一种易于执行的单管方法，可在大约两小时内得出结果。此外，HRM技术不限于培养材料，而是能够检测直接从组织样本中提取的临床样本中的DNA [6] 。

3. HRM技术的应用

3.1. HRM技术在结核分枝杆菌菌种鉴定中的应用

与传统的检测方法相比，该检测方法可利用临床痰标本直接检测，无需使用阳性培养物进行检测，同时受标本中细菌量的多少和细菌的纯度影响较小；HRM技术具有极高的灵敏度，通过选取不同的靶基因合成不同的引物，可对临床常见的结核分枝杆菌进行分型，检测出单个碱基之间的差别，形成相应的特征曲线，HRM技术和传统罗氏培养法的结果相比较，差异无统计学意义(P > 0.05) [2] [7] [8] [9] 。Landoilt等 [6] 通过以位于gyrB的SNPs为基础的HRM技术，验证了HRM技术在鉴定结核分枝杆菌复合体(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)的分型中较高的特异性及灵敏性。

3.2. HRM技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用

由于抗结核药物的滥用，控制肺结核任务更加艰巨，开发和应用快速、准确的检测方法，是推进结核病实验室诊断的最佳策略。研究者们通过HRM技术对结核分枝杆菌的耐药相关基因进行分析，根据检测位点的突变情况来判断其耐药性。

1) 利福平：利福平为利福霉素类半合成广谱抗生素，利福平与结核分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶的β亚基(ropB蛋白)特异性结合，通过阻断mRNA的转录，起到杀菌作用，利福平耐药基因突变主要集中在ropB蛋白基因长度为81 bp的热点区域 [10] 。近年来，针对利福平耐药决定区决定区(rifampician resistance determining region, RRDR)的研究成为了热点。Zaw等 [11] 回顾了2010年至2016年间发表的关于RIF耐药突变的文献，发现ropB基因RRDR中最常见的突变密码子是531、526、516，其中531位点氨基酸发生突变最为广泛。

当前，利福平耐药相关基因的研究已较明确，HRM技术对结核耐药的检测主要针对ropB基因 [12] [13] 。杨敏等 [12] 对21株利福平耐药菌株进行检测，其敏感性为86.36%、特异性为92.59%。杨彩虹等 [13] 通过HRM技术对利福平耐药性进行检测，发现84株菌株ropB基因RRDR区中存在7个突变位点，3种突变形式，在23株利福平耐药菌株中，以531位密码子单位点突变为主，其敏感性为83.3%、特异性为95%。这些检测结果均提示HRM技术用于检测的敏感性和特异性均较高，为以后进行其他相关研究提供参考。

2) 异烟肼：异烟肼是一种半合成的杀菌类抗生素，具有较强的杀菌力，通过阻碍生长繁殖期的结核分枝杆菌细胞壁的合成、干扰代谢和干扰酶的活性而发挥其杀菌作用，可有效杀除细胞内外的结核分枝杆菌。异烟肼耐药分子机制非常复杂，其耐药性与多基因的多位点突变有关，例如过氧化氢酶–过氧化物酶基因(katG)、烯酰基-ACP还原酶基因(inhA)及其启动子烷基过氧化氢还原酶基因(ahpC)，以及oxyR和ahpC (oxyR-ahpC)基因之间的基因间区域，其中katG突变和inhA启动子区突变被认为是导致INH耐药的主要分子机制 [14] [15] 。

katG基因常见的点突变位点是第315位氨基酸，Ser315Thr被认为是INH耐药的主要原因，katG基因第315位氨基酸突变可能是由于katG氧化酶活性的丧失，保留了其过氧化氢酶活性 [16] [17] 。inhA是一种参与脂肪酸合成的关键酶，主要是真菌酸生物合成，是NADH依赖性酰基载体蛋白激酶家族的一部分。inhA是异烟肼的主要靶点，它需要通过katG将异烟肼氧化与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合的酰基自由基来激活，形成复合物 [18] 。ahpC为烷基–过氧化氢还原酶的结构基因，该还原酶还原细胞内各种过氧化物底物，它能控制解毒酶基因的表达，如katG基因的表达 [19] 。oxyR基因既是基因转录的活化剂又是氧压的感应器，控制katG和ahpC编码。ahpC的突变极少，主要集中在oxyR-ahpC基因间隔区内，在异烟肼耐药菌株中ahpC启动子序列的突变常伴随着katG活性的不足 [20] [21] 。

异烟肼耐药相关基因较多，耐药机制比较复杂，目前研究人员使用HRM技术检测异烟肼耐药主要针对其主要基因。杨彩虹等 [22] 对20株异烟肼耐药菌株进行katG和inhA启动子区域分析，发现katG基因有4种突变类型，分别是234单位点突变，234、315双位点突变，234、463双位点突变，234、315、463三位点联合突变；发现inhA基因有3种突变类型，即-8位、-15位、-152位；敏感性为95%，特异性为82.76%。Parsa等 [23] 对431株耐药结核分枝杆菌分离株进行检测，88.8%的异烟肼抗性样本在katG基因和mabA-inhA启动子区发生突变，其中最高的突变发生在katG基因的密码子315 (AGC→ACC)，敏感性为83.3%，特异性为98.8%。Anthwal等 [24] 对结核分枝杆菌分离株进行检测，发现约85%在katG基因的315密码子处显示突变，其余15%在inhA区域内显示突变，katG测定的敏感性为86.4%，特异性为100%，inhA基因测定的灵敏性及特异性均为100%。随着对异烟肼耐药相关基因和耐药机制的进一步研究，其敏感性及特异性必定会得到较大提高。

3) 乙胺丁醇：乙胺丁醇为结核菌阿拉伯糖转移酶抑制剂，与细胞壁合成有关，同时，该药破坏细菌细胞壁屏障作用，有利于亲脂性抗结核药物如利福平进入菌体内，增强抗菌活性 [25] [26] 。结核分枝杆菌对乙胺丁醇耐药性的产生主要与embCAB基因突变有关，且以embB基因，该基因突变导致糖基转移酶结构改变，影响了乙胺丁醇和糖基转移酶的结合而产生耐药，特别是在密码子306、406和497处，它们被认为是热点耐药密码子 [26] 。

Rezaei F等 [27] 使用HRM技术对21株乙胺丁醇耐药菌株进行分析，发现11株在embB基因的306密码子处显示突变，5株在497密码子处显示突变，2株在40密码子处显示突变，1株在366密码子处显示突变，测得敏感性和特异性分别为90.4%和96.6%。

4) 链霉素：链霉素是氨基环醇糖苷类抗菌药物，主要干扰结核分枝杆菌蛋白合成多个环节 [25] ，编码小亚基核糖体蛋白S12的rpsL基因和编码16sRNA的rrs基因突变是结核分枝杆菌耐链霉素的主要分子机制 [28] 。Rezaei等 [27] 使用HRM技术对25株链霉素耐药菌株进行rpsL基因和rrs基因分析，发现52%的耐药菌株在rpsL基因上发生突变，其中28%在第43位点发生突变，20%在第88位点发生突变，4%在第44位点发生突变；发现36%的耐药菌株在rrs基因上发生突变，测得敏感性和特异性分别为88%和100.0%。杨彩虹等 [29] 通过HRM技术对84株结核分枝杆菌分离株进行rpsL基因和rrs基因分析，其中24株链霉素耐药菌株，23株在rpsL基因发生突变，1株在rrs基因发生突变，敏感性为75%，特异性为85.9%。

5) 吡嗪酰胺：吡嗪酰胺经结核分枝杆菌细胞内的吡嗪酰胺酶代谢为吡嗪酸，后者通过影响结核菌脱氢酶而干扰结核菌代谢发挥抗菌作用 [25] 。其耐药性是由于一些靶标基因突变产生的，包括编码吡嗪酰胺酶的pncA基因、编码30S核糖体蛋白质S1的rpsA基因、编码天门冬氨酸脱羧酶的panD基因等 [30] ，结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺的分子机制主要是pncA基因，特别是密码子63、138和14处。Filipenko等 [31] 通过HRM技术对38株吡嗪酰胺耐药株进行pncA基因分析，其中33株出现了该基因氨基酸序列修饰突变，敏感性及特异性分别为88.57%和82.61%。

6) 氟喹诺酮类：氟喹诺酮类药物属于广谱抗生素药物，主要作用于结核分枝杆菌的DNA旋转酶，目前认为氟喹诺酮类药物耐药机制主要为耐药基因决定区(QRDR) gyrA基因或gyrB基因的突变，其中QRDR的gyrA基因突变为主要机制 [32] 。杨彩虹等 [33] 通过HRM技术对对84株结核分枝杆菌分离株氧氟沙星耐药性检测，检测出14株为氧氟沙星耐药菌株，8株为gyrA90/gyrA94突变的菌株，HRM检测菌株耐药性的敏感性为75%、特异性为93.1%，检测gyrA基因耐药突变的敏感性为80%、特异性为91.9%。Sirous等 [34] 对32种耐药分离株进行gyrA基因分析，发现5株为氧氟沙星耐药菌株，其中80%在gyrA基因发生突变，敏感性和特异性分别为80%和100%。

4. 讨论

HRM技术为一项近年来新兴分子生物学技术，目前开展该项技术的医院较少，在结核分枝杆菌的检测上缺少临床数据的支持。同时，HRM技术也存在一些不足，一方面，目前HRM技术检测主要针对的临床常用的抗结核药物，尤其是一线药物耐药相关基因的高频位点，今后可以扩大位点范围和检测药物种类 [35] 。另一方面，有研究表明，HRM技术测定的准确性在很大程度上取决于样品来源，制备，提取的DNA的质量、浓度、扩增子长度、GC含量、设备和染料，当使用新鲜样品或小于600 bp的片段进行HRM时，可以实现更高的灵敏度，因为DNA可能在采样过程中退化 [35] ，因此建立标准的优化程序，可在一定程度上增加HRM技术测定的准确性。

综上所述，HRM技术用于结核分枝杆菌的检测，虽然在检测的稳定性及可靠性方面，与表型药敏试验的结果存在一些偏差，但该技术也有其优势，如高敏感性、高特异性、低成本、污染少、节约时间等，HRM技术可以在临床实践中起到较好的辅助诊断作用，为应用于临床进行早期、有效的检测，为临床医师提供用药思路，早日治疗结核病提供帮助。

文章引用

解炳倩,王玉清. 高分辨率熔解曲线在结核分枝杆菌检测中的应用
Application of High-Resolution Melting Curve in the Detection of Mycobacterium tuberculosis[J]. 临床医学进展, 2023, 13(06): 9098-9103. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.1361274

参考文献