¹贵州中医药大学，贵州 贵阳

²贵州民族大学，贵州 贵阳

收稿日期：2021年12月2日；录用日期：2022年1月4日；发布日期：2022年1月11日

摘要

目的：运用网络药理学的方法，探讨复方龙丹颗粒干预子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)的潜在作用机制，为其新药研发及基础研究提供依据。方法：通过TCMSP、ETCM、TCM-MESH等数据库检索复方龙丹颗粒中化合物成分信息，利用SwissADME平台及PharmMapper数据库筛选出其活性成分及作用靶点；采用GeneCards、DrugBank、OMIM、DisGeNet等数据库筛出与子宫内膜异位症的相关靶点，通过BisoGenet构建PPI网络，根据网络属性值筛选出关键靶点；同时分别采用ClueGO插件及Metascape平台对关键靶点进行KEGG、GO的富集分析，得到潜在的作用通路，并构建靶点–通路网络。结果：复方龙丹颗粒中筛选得到121个活性成分，经筛选与子宫内膜异位症相关的关键作用靶点156个，涉及白细胞介素17信号、类风湿关节炎等54条相关通路，参于细胞质翻译、mRNA结合等631个相关生物过程。结论：通过网络药理学揭示了复方龙丹颗粒可通过多成分、多靶标、多信号通路治疗子宫内膜异位症，为子宫内膜异位症的治疗及机制研究提供依据和思路。

关键词

复方龙丹颗粒，网络药理学，子宫内膜异位症症，作用机制

Study on the Mechanism of the Compound Long Dan Granules in Treating EMs Based on Internet Pharmacology

Linlin Du¹, Xiangpei Wang², Fengyun Jing¹, Feng Xu¹, Hongmei Wu^1*

¹Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou

²Guizhou Minzu University, Guiyang Guizhou

Received: Dec. 2^nd, 2021; accepted: Jan. 4^th, 2022; published: Jan. 11^th, 2022

ABSTRACT

Objective: To use the method of network pharmacology to explore the potential mechanism of the compound Long Dan granules intervention in endometriosis (Endometriosis, EMs), and to provide a basis for its new drug development and basic research. Methods: Search the compound information of compound Long Dan granules through TCMSP, ETCM, TCM-MESH and other databases, use SwissADME platform and PharmMapper database to screen out their active ingredients and targets; use GeneCards, DrugBank, OMIM, DisGeNet and other databases to screen out. For the targets related to endometriosis, the PPI network was constructed through BisoGenet, and the key targets were screened out according to the network attribute values; at the same time, the ClueGO plug-in and Metascape platform were used to perform KEGG and GO enrichment analysis on the key targets, and the results were obtained potential pathways of action, and built a target-pathway network. Results: 121 active ingredients were screened in the compound Long Dan granules, and 156 key targets related to endometriosis were screened, involving 54 related pathways such as interleukin 17 signaling and rheumatoid arthritis, 631 related biological processes such as cytoplasmic translation and mRNA binding. Conclusion: Through network pharmacology, it is revealed that the compound Long Dan granules can treat endometriosis through multi-component, multi-target, and multi-signal pathways, and provide basis and ideas for the treatment and mechanism research of endometriosis.

Keywords:Compound Long Dan Granules, Network Pharmacology, Endometriosis, Mechanism of Action

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)是一种表现为盆腔疼痛和不孕的慢性疾病，是现妇科临床常见疑难病之一，患者不孕症发病率为25%~67%。其病变可以波及腹腔、呼吸道、四肢等全身各处 [1]。EMs虽多为良性疾病，但它所引起的疼痛、月经异常及不孕症等给妇女的健康和生活带来极大困扰，疼痛是其主要临床表现之一，主要为肛门坠胀痛、非周围性盆腔疼痛等，其中约70% EMs患者存在痛经现象 [2]。在自然受孕率方面，EMs不孕患者即使借助辅助生殖技术，着床成功率仍然低于非EMs的不孕患者，其提高临床妊娠率也成为目前面临的困境 [3]。EMs所引起的疼痛、月经异常及不孕症等，给妇女的健康和生活带来极大困扰，影响着女性的生殖需求和生活品质，对其治疗也是医学界一直需要努力攻克的难题。

近年来，临床发现EMs发病率呈逐年上升的趋势，但其具体病因仍无明确定论，在临床治疗EMs的方法主要包括期待治疗、药物治疗、手术治疗和联合治疗等，随着医疗事业的不断发展，中药治疗、保守术后中药治疗成为许多患者的第一选择。复方龙丹颗粒是贵州中医药大学第二附属医院妇科长期临床经验方，并以辩病与辨证相结合，以长期临床数据结果按中医组方原则进行组方，方中以龙血竭、三棱、延胡索、莪术为君药，以牡丹皮、大黄、杠板归为臣，佐以当归、山茱萸、赤芍诸味以增强君臣诸药之力；而以木香、桂枝为使，具有活血化瘀，补肾固脱等功效，对子宫内膜异位症、子宫内肌瘤有很好的治疗效果 [4]。但目前对于复方龙丹颗粒治疗EMs的药理学作用机制研究较少。为更好地了解复方龙丹颗粒的治疗EMs作用机制，本研究通过网络药理学的方法，在分子的水平上，从化学成分、作用靶点和信号传导通路对复方龙丹颗粒的治疗EMs作用机制进行系统研究，以期为进一步揭示复方龙丹颗粒的药理作用机制提供理论基础。

2. 方法

2.1. 相关成分及靶点筛选

由于现存公开数据库的信息有限、各有优势，为保证数据的全面性与准确性，通过TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、ETCM数据库(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)、TCM-MESH数据库(http://mesh.tcm.microbioinformatics.org/)多个数据库对复方龙丹颗粒中13味中药的化学成分信息收集并结合查阅文献进行补充，对化学信息进行整合与去重，再通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取活性成分sdf分子结构，后将所获取化合物结构输入SwissADME平台(http://www.swissadme.ch/)。在预测结果的参数中，将gatrointestinal absortion、GIabsortion为“High”及Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge有2个或2个以上为“Yes”纳入我们的潜在作用化合物中，其后通过文献核查根据筛选标准所排除的化合物，若化合物药理作用明显且与研究主题相关，仍予以纳入，最终获得相关主题的潜在化合物。我们利用PharmMapper数据库(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)获取潜在化合物的靶点，选择归一化拟合分数(Normalized Fit Score, NF)≥0.9的靶点蛋白，并根据已发表的药物相关成分文献报道，补充未预测到的活性化合物的已知靶点。

2.2. 疾病相关靶点获取

为保证数据的准确性与全面性，以“Endometriosis”、“Endometriosis Uterina”、“EMT”、“EMs”等子宫内膜异位症相关名词为关键词，通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)及DisGeNet数据库(http://www.disgenet.org/home/)，检索筛选其基因和蛋白靶点，建立子宫内膜异位症靶点数据集。将疾病靶点与药物成分的潜在靶点均经UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将疾病靶点与药物成分统一规范，而后进行合并去重，作为复方中活性成分治疗子宫内膜异位症的疾病靶点。

2.3. 复方龙丹颗粒“活性成分–靶点”网络构建和分析

使用软件Cytoscape 3.7.2 [5] 软件来构建复方龙丹颗粒“活性成分–靶点”网络，其中用“节点”(node)表示成分或靶点，用“边”(edge)表示二者之间的关系；使用Network Analyzer工具分析网络特征，即连接度(degree)、介度(betweenness)及紧密度(closenesss)等，以研究活性成分与靶点及其之间的关系。

2.4. PPI网络构建与分析

利用BisoGenet构建蛋白质互作网络(Protein-Protein Interaction, PPI)，将复方龙丹颗粒中活性成分靶点及子宫内膜异位症靶点分别导入BisoGenet内，各自生成1个PPI网络，通过Cytoscape3.7.2软件中的Merge功能提取2个PPI网络的交集网络，利用Cytoscape中的cytoNCA插件 [6] 分析交集网络中各个节点的属性值，即使连接度中心性(Degree Centrality, DC)、网络中心性(Network Centrality, NC)、局部平均连通性(Local Average Connectivity, LAC)，其对应的计算公式分别为 $DC\left(u\right)=d_u$ [7]、

$NC\left(u\right)={\displaystyle {\sum }_{v\in N_u}\frac{Z_{u,v}}{\min \left(d_u-1,d_v-1\right)}}$ [8]、 $LAC\left(u\right)=\frac{{\displaystyle {\sum }_{w\in N_v}\mathrm{deg}{C}_v\left(w\right)}}{\left|N_u\right|}$ [9]， $d_u$ 和 $d_v$ 是u和v在网络中的度，

$N_u$ 表示的是u邻接节点的集合， $Z_{u,v}$ 是包括边 $\left(u,v\right)$ 的三角形个数； $C_u$ 是 $N_u$ 对应的子图， $\mathrm{deg}{C}_u\left(w\right)$ 是在子图 $C_u$ 中w对应的度。通过计算交集PPI的网络拓扑学特征属性值其公式为并对结果进行筛选，从而得到关键靶点。

2.5. 关键靶点KEGG通路富集分析

借助Cytoscape3.7.2软件中的ClueGO [10] 插件，选择P ≤ 0.01，Kappa score：0.4，对复方龙丹颗粒治疗子宫内膜异位症的关键靶点进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia Genes and Genoms, KEGG)通路分析并对结果进行可视化。

2.6. 关键靶点GO功能富集分析

利用Metascape平台(http://metascape.org/)将复方龙丹颗粒治疗子宫内膜异位症核心靶标蛋白基因上传进行基因本体论(Gene Ontology, GO)分析，其中包括生物过程(Biological Process, BP)、分子功能(Molecular Function, MF)和细胞成分(Cellular Component, CC)三个部分，对各个模块分析结果按照P值从小到大排序，且以P ≤ 0.01为筛选条件，对符合条件的前30条信息进行可视化。

3. 结果

3.1. 复方龙丹颗粒“活性成分–靶点”网络图构建

通过上述数据库获得复方中121个相关活性成分，利用相关技术对活性成分进行作用靶点预测，排除重复靶点，共获得预测靶点306个。利用Cytoscape软件及使用Network Analyzer工具分别对活性成分和作用靶点关系进行绘制和分析，其中按Degree值排列前8的活性成分为：槲皮素(quercetin)、儿茶素[(+)-catechin]、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、异鼠李素(isorhamnetin)、龙血素C (Loureirin C)、鞣花酸(ellagic acid)、常春藤皂苷元(Hederagenin) (见表1)。从构建复方龙丹颗粒“活性成分–靶点”网络，共获得586个节点(node)与1763条边(edge)，图中节点的大小代表相应的连接度值(degree)，节点面积越大代表度值越大，表示涉及的生物功能越多，其生物学重要性越高，见图1。

表1. Degree值排列前8的活性成分

图1. “活性成分–潜在靶点”网络图

3.2. 复方龙丹颗粒治疗子宫内膜异位症的PPI网络构建

运用Cytoscape 3.7.1软件中的BisoGenet功能，分别构建复方龙丹颗粒和子宫内膜异位症的PPI网络，发现复方龙丹颗粒潜在靶点可与6497个靶点产生直接或间接作用，而这些靶点之间的相互关系可达153,637种。与此同时，对子宫内膜异位症相关的靶点绘制PPI网络，显示与其直接或者间接相关的靶点可达9285个，这些靶点之间的相互联系可达200,083种，两者交集网络见图2。

图2. PPI网络交集网络图

3.3. 复方龙丹颗粒治疗子宫内膜异位症关键靶点筛选

为获取PPI网络中更丰富的节点连接信息以及优化节点信息传递效率，充分明确在网络中发挥重要作用的靶点，本文通过Cytoscape中的cytoNCA插件对PPI交集网络进行拓扑学分析，以特征属性值(DC、NC、LAC)，通过2次属性值筛选，共获得关键靶点156个，具体筛选策略见图3，最终筛选得到的蛋白互相作用关系，见图4。

图3. 关键靶点筛选策略图

图4. 关键靶点蛋白互作网络图

3.4. 关键靶点的GO功能富集分析

将复方龙丹颗粒治疗子宫内膜异位症核心靶标蛋白基因上传到Metascape数据库中，设置参数P ≤ 0.01，开展GO功能的富集分析，共富集得到631个条目，保存其结果根据显著性P值筛选前30条生物过程数据并使用R语言绘制气泡图(bubble chart)，结果见图5。气泡颜色由绿色到红色代表P值从小到大，P值越大代表显著性越强，气泡越大代表该通路的基因计数(count值)越大，横轴代表该通路基因所占总体输入基因的比率(Ratio)。数据显示其生物过程包括：细胞质翻译(cytoplasmic translation)、RNA剪接(RNA splicing)、蛋白质稳定性的调节(regulation of protein stability)、mRNA结合(mRNA binding)、核糖核蛋白复合物结合(ribonucleoprotein complex binding)等。

图5. GO富集分析可视化图

3.5. 关键靶点的KEGG功能富集分析

借助Cytoscape 软件的ClueGO插件，选择P ≤ 0.01，对复方龙丹颗粒治疗EMs的关键靶点进行KEGG信号通路分析，得到54条KEGG信号通路，分别涉及到IL-17信号通路、前列腺癌、类风湿关节炎、膀胱癌、雌激素信号通路等，其中IL-17信号通路为显著性最高的通路，见图6、图7。按照显著性选取前13条通路构建相关靶点–通路网络图(图8)，靶点通路富集结果见表2。

图6. KEGG信号通路图

图7. KEGG富集分析饼图

表2. 靶点通路富集结果

图8. “靶点–通路”网络图

4. 讨论

本研究基于网络药理学，筛选得到复方龙丹颗粒活性成分121个，其中以槲皮素、儿茶素、β-谷甾醇、山柰酚等为主要活性成分，同时筛选到与子宫内膜异位症可能相关的关键靶点，构建复方龙丹颗粒“活性成分–靶点”网络。通过PPI网络互作筛选出IL6、ARDBP、IL1B、EIF4A3、RPS2、RPL6、TNF、FOS、RPSA、ILF3、RPS8等156个相关靶点，其中IL6、TNF、IL1B为典型的炎症因子，这是否也提示了复方龙丹颗粒可能通过抗炎的作用来治疗EMs；将上述相关靶点经过GO富集和KEGG通路注释分析结果，发现54条信号通路及631个生物过程参与复方龙丹颗粒治疗EMs的作用，其中以IL-17信号通路较为显著。在复方龙丹颗粒主要活性成分中，有研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等作用 [11] [12] [13]，可抑制大鼠子宫内膜异位症模型中异位子宫内膜的生长 [14] [15] [16]。山柰酚能够抑制细胞生长，可激活调节促凋亡和抗凋亡蛋白表达来诱导癌细胞凋亡 [17]，但目前对于山奈酚治疗子宫内膜异位症的研究鲜有报道，若开展深入研究也可作为治疗子宫内膜异位症的另一途径。

5. 结论

目前在治疗子宫内膜异位症时，主要是通过抑制垂体促性腺激素和卵巢激素的分泌直接作用于病变子宫内膜从而缓解症状，如口服避孕药、孕激素、孕稀三酮等 [18]。但由于这些激素类药物长期服用有一定的副作用且易出现复发、效果欠佳等问题。现临床上采用中西药联合用药来治疗子宫内膜异位症，并取得了一定的成效，由于传统中药大多通过多成分、多靶点、多途径协调作用而发挥治疗目的，而中药的化学成分种类非常复杂，难以全面阐明其中的药效物质基础和作用机制。

本研究通过IL6、ARDBP、IL1B等筛选的相关靶点进行GO富集和KEGG通路注释，经分析和计算结果发现IL-17信号通路的显著性较高，IL-17是机体重要的炎症因子，有研究显示IL-17与CD40配体作用后促进上皮细胞产生IL-6、TNF-α等细胞因子进而放大炎症效应 [19]，并且IL-17刺激细胞产生TNF-α和IL-6，对NF-κB信号通路的激活反应具有正反馈作用 [20]。TNF-α和IL-6通过下调TLR2介导的ERK1/2磷酸化使NF-κB激活，而NF-κB在调节T细胞自身免疫和炎症功能方面又发挥着至关重要的作用 [21]。由此，我们推论复方龙丹颗粒可能通过IL-17、NF-κB等相关炎症信号通路的相互作用及靶点来达到治疗EMs的作用。这也为进一步研究复方龙丹颗粒治疗子宫内膜异位症作用机制指明方向，为后续实验研究治疗子宫内膜异位症提供新的思路。但是鉴于网络药理具有局限性，还需通过严格的动物体内实验及细胞体外实验进一步验证。

基金项目

贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(项目合同编号：黔科合中专[2004]44号)、贵阳市科技局中药现代化专项(项目合同编号：[2007]筑科农合同字第3-1号)。

文章引用

杜琳霖,王祥培,靳凤云,徐 锋,吴红梅. 基于网络药理学探讨复方龙丹颗粒治疗EMs的作用机制研究
Study on the Mechanism of the Compound Long Dan Granules in Treating EMs Based on Internet Pharmacology[J]. 生物医学, 2022, 12(01): 27-38. https://doi.org/10.12677/HJBM.2022.121004

参考文献