ABSTRACT

Norovirus (NV) may cause acute gastroenteritis with highly contagious, an outbreak of NV infection involves a large number of people which can easily cause panic. However, the pathogenesis of NV infection is unclear by now. Epidemiological studies have found that oysters can specifically enrich NV and thus become the primary approach of food-borne infection of NV, while the mechanism of its biological enrichment process is also not clear. Studies have shown that human FUT2 polymorphism can affect NV recognition and infection. And experiments have discovered the similar NV recognition receptors in oysters. We found significant differences in NV enrichment between different oyster individuals, but it is not clear whether this difference is related to the polymorphism of FUT2 gene. This study intends to screen polymorphic sites of oyster FUT2 gene using high-throughput sequencing, and develop polymorphic markers of oyster FUT2 gene by high-resolution melting curve and fluorescence quantitative PCR. This study laid a foundation for exploring the mechanism of oyster enrichment NV. It also provides new insights into NV infection in humans and contributes to develop prevent and treat methods.

Keywords:Oyster, FUT2, SNP, Norovirus

牡蛎富集诺如病毒相关FUT2基因单核苷酸 多态性标记开发

闫守泉¹，宋丽君²，周玉兰³，蒋华生¹，王家丰^1*

¹广东医科大学附属医院，干细胞研发与临床转化中心，广东 湛江

²广东医科大学附属医院，生殖医学中心，广东 湛江

³广东医科大学附属医院，临床研究中心，广东 湛江

收稿日期：2019年6月25日；录用日期：2019年7月9日；发布日期：2019年7月16日

摘 要

诺如病毒(NV)可导致急性肠胃炎并具有高度的传染性，一次爆发涉及人数众多，极易引起恐慌。NV致病机理尚不明确，流行病学研究发现牡蛎可特异性富集NV而成为食源感染NV最主要途径，而其生物富集过程机理也不清楚。研究表明人体FUT2多态性会影响NV识别与感染，实验表明牡蛎体内存在类似人体NV识别受体。我们研究发现不同牡蛎个体间NV富集存在显著差异，该差异是否与FUT2多态性相关尚不清楚。本研究拟借助高通量测序等方法筛选牡蛎FUT2多态性位点，然后利用高分辨率熔解曲线以及荧光定量PCR等技术开发、验证FUT2多态性标记。本研究为探索牡蛎富集NV过程机理奠定基础；同时为进一步明确NV感染人体过程以及相关预防和治疗措施提供新思路。

关键词 :牡蛎，FUT2基因，单核苷酸多态性，诺如病毒

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1. 引言

食用海洋贝类尤其是牡蛎经常可引起具有高度传染性的急性肠胃炎，表现为严重的腹泻、呕吐，传染与传播速度极快。研究发现此类非细菌性急性肠胃炎是由诺如病毒(Norovirus, NV)感染引起的 [1] [2] [3] [4]，NV又称诺瓦克样病毒(Norwalk-like viruses)，为单股正链RNA病毒，属于杯状病毒科(Caliciviridae family)。NV是一种重要的食源性病毒，主要通过粪–口途径和人–人途径传播，最常见感染途径是接触被污染的食物、水和病人 [5]。贝类属于滤食性动物，滤食的同时其消化道可以特异性富集随污水带来的NV，导致其消化道病毒浓度高出生长环境的几十甚至上千倍 [6]。美国CDC (http://www.cdc.gov/norovirus/)统计认为贝类是食源性NV摄入的主要来源。马丽萍等检测了我国黄、渤海区7个采集点840例不同贝类样本NV污染情况，平均检出率为13.33% (112/840)，其中牡蛎的检出率最高，达到19.35% (30/155) [7]。因此贝类特别是牡蛎(oyster)作为NV中间寄生体，成为最常见的NV食源传播载体，生吃或者食用没有彻底加热的牡蛎很容易引起NV感染 [8] [9]。

研究证明NV与人类组织血型抗原(histo-blood group antigens, HBGAs)识别并以之为受体引发感染，目前已经有8种特异性的NV-HGBAs结合模式已经被描述 [10] [11] [12] [13]。HGBAs主要的效用部分是其糖链结构，其最主要的合成酶是由岩藻糖基转移酶(FUT)基因编码的 [14]。人体中主要有3种FUT基因，2种α-l,2岩藻糖基转移酶FUT1 (H基因)和FUT2 (Se基因)可作用于前体链合成H抗原(即O抗原)。FUT3 (Le基因)则参与Lewis血型抗原合成，作用于I型/II型链合成Lea/x，或者修饰H1/2抗原产生Leb/y。研究发现FUT2基因突变导致相应的酶失活后可以导致“非分泌型”个体，“非分泌型”个体对NV有天然的免疫性，不会被NV识别感染 [15]。不同地域人群发现多种不同突变导致的“非分泌型”，例如在129密码子发生的se385突变导致相应酶仅表现微弱活性，在143密码子处发生的se428突变则直接导致无酶活性 [16] [17]；此外还有se302，se571以及se778等突变均能影响酶活性 [18] [19]。目前，在人类FUT2基因中已经有超过21个不同的SNP位点被报道 [20]，说明FUT基因的遗传多态性与NV识别与结合有极为密切的关系。

Tain等发现NV能够特异性结合到牡蛎消化系统，并利用ELISA实验证实作为NV寄生体的牡蛎中存在A-HBGAs类似受体，牡蛎正是通过HBGAs类似受体与NV识别并选择性富集 [21] [22]。刘帅帅等人 [23] 利用ELISA检测到牡蛎中同时存在A-HBGAs和H-HBGAs。上述事实表明牡蛎富集NV与其体内HBGAs类似受体密切相关。此外，相同海域的相同地点的不同牡蛎个体对NV的识别和富集能力也存在明显差异，不易染毒的牡蛎中是否也存在类似人体“非分泌型”机制目前尚不明确。也尚未有描述牡蛎FUT2基因突变的报道。

如今，牡蛎基因组测序图谱已经发布 [24]，我们在牡蛎基因组找到FUT2基因序列信息。此外，利用前期高通量转录组测序数据与基因组比对，发现FUT2基因包含有多个多态性位点。目前也没有牡蛎FUT2基因多态性开发验证的研究报道。本研究拟通过牡蛎转录组与基因组同源比对方法开发FUT2基因的多态性位点，为将来进一步研究NV的识别机制奠定良好基础。

2. 实验材料与方法

2.1. 牡蛎样本获取与核酸提取

从青岛以及湛江多个沿海潮间带收取牡蛎样本共计60个个体。牡蛎刀开壳后收取闭壳肌与外套膜等组织，用于转录组测序的样本置于液氮保存；用于突变位点筛选验证的样本先置于60%乙醇水溶液中保存，并在取样后每隔1天分别更换70%、80%、90%乙醇水溶液直至更换为无水乙醇，然后更换两次无水乙醇直至样本已经充分脱水后常温储存。

表1. 项目使用的牡蛎样本及用途分配

QD：青岛，QH：秦皇岛，DL：大连。China：三组合并。

利用组织基因组DNA提取试剂盒(Promega Corp., Wisconsin, USA)提取基因组DNA。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并利用Nano Drop 2000 (Thermo美国)检测DNA浓度和OD260/OD280值。

2.2. 牡蛎FUT2基因克隆测序及其突变位点筛选

1、转录组高通量转录组测序：每组20个样本混合，共形成三个转录组混合样本(分别来自QD，DL和QHD，表1)，利用多地区的多个体混合RNA进行转录组测序以增加获得更全面的基因突变类型的几率，尽量减少遗漏等位基因频率很小的位点。混合样本转录组测序采用短序列Illumina测序方式，物种鉴定以及高通量转录组测序具体步骤流程参考前期试验方法 [25]。

2、多序列比对与FUT2突变位点发掘：将克隆测序获得牡蛎FUT2基因序列数据、高通量测序获得的序列数据以及3个牡蛎转录组序列数据与基因组参考序列一起进行多序列比对筛选SNP，筛选标准简单表述如下：

1) 每个位点的测序深度不小于20；

2) 最小等位基因在高通量测序中中至少有4个序列/reads覆盖到；

3) 鉴于基因组测序深度超过150×，因此，若在所有测序DNA序列以及转录本中只存在一个等位基因但该等位基因与基因组序列不同，认定为候选突变位点。

2.3. 引物设计与筛选

按照以下原则筛选候选SNP位点进行引物设计：

1) 在序列保守区域选择候选SNP位点。

2) 候选位点周围不存在另外的突变，有足够的的侧翼序列设计引物。

3) 扩增片段长度介于40~100 bp之间，每个扩增子中仅包含一个候选位点。

4) 引物熔解温度设置为50℃~60℃。

5) 尽量避免引物在目标位置外有错配位点，同时避免引物二聚体。

使用Primer Premier 5设计引物，所有引物均交由生工(上海生工生物)合成。利用PCR反应试剂盒(TaKaRa, 大连)进行PCR扩增实验，PCR热循环如下：95℃预热10分钟，然后运行40个温度循环，每个循环包括94℃持续30 s，Tm持续30 s，72℃持续30 s；最后运行后延伸72℃持续10 min。用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物质量，选取电泳条带单一，扩增效率高的引物对进行后续实验。

2.4. 扩增片段HRM分析

分型引物经PCR扩增后添加LCgreen和高、低温内标后在LS96仪器(Idaho, USA)上运行HRM。温度变化速率设定为0.1℃/s，收集产物熔解过程50℃~95℃之间的荧光信号，通过分析溶解曲线获得候选突变位点的等位基因信息。

3. 实验结果

3.1. 核酸提取与评价

基因组DNA提取后琼脂糖凝胶电泳检测发现DNA条带大小符合预期，仅有少量未完全降解的RNA，但完整性良好，经过RNA降解处理后符合SNP分型要求。

3.2. 转录组测序结果

转录组测序共计产生163.7 M测序读长(reads)，与现有牡蛎基因组比对后发现有127.4 M reads能够比对到基因组，比对比例达77.8%。三个转录组测序数据分布均匀，与基因组的对比率分别均高于76%，测序质量良好(见表2)。

表2. 转录组测序与MAP到牡蛎基因组情况

^*QD：青岛，QH：秦皇岛，DL：大连。China：三组合并。

3.3. FUT2基因序列确定

以现有牡蛎基因组序列信息作为参考，利用转录组数据比对到基因组FUT2基因序列并通过多序列片段比对分析筛选SNP位点。序列比对共发现有14条序列符合FUT2基因同源比对，这些序列存在相互交叉重叠，分别对应1~7条转录本。其中有两条序列(LOC105330520, LOC105332210)对应最多的转录本，分别有7条和5条转录本，且不同转录本间的序列同源性最好。为了保证开发的SNP标记有良好的保守型，我们利用这两条长度最长，包含转录本最多的两条序列(LOC105330520, LOC105332210)作为参考来开发SNP标记。

3.4. SNP标记开发

按照前述原则在筛选出8个位点，其中包括LOC105330520序列上2个位点，LOC105332210序列上6个位点，8个位点均分布在两条序列的后半段序列保守区。大多数位点突变类型为R类型(A/G)，共有5个R突变位点，另外有两个S类型(C/G)突变一个Y类型(T/C)突变(表3)。针对性设计高分辨率熔解曲线(HRM)引物，初步引物筛选发现均符合HRM要求。以20个养殖群体样本为模板，所有引物经过PCR扩增反应后运行HRM，有5个位点能够获得稳定溶解曲线分型结果(图1)。

图1. HRM熔解曲线图

表3. FUT2基因SNP位点开发引物信息

Continued

注：粗体字表示能够获得稳定HRM分型结果的引物对。

4. 讨论与结论

目前为止，由于缺乏成熟的细胞培养系统和动物模型，对NV的复制、组装、免疫特性等方面的研究进展缓慢，NV感染人类引发疾病的具体机制仍然尚未明确，目前尚无疫苗或相关特效药物，主要以预防为主。人类FUT2基因表达具有显著的组织特异性，研究表明在目前已知的人体组织中与消化系统相关的组织中FUT2基因表达量显著高于其他组织(图2)；而牡蛎可特异性富集NV，因此食用牡蛎成为人类感染NV重要的风险因素。作为研究NV感染的重要部分，从传播途径入手，研究遗传因素对NV在贝类寄生体内识别和生物富集过程的影响，有望利用遗传学手段开发能减少或阻断NV通过贝类传播的有效方法，也为NV感染的预防和治疗提供新思路。

图2. 人FUT2基因在体内各组织样本中的表达量示意图(来源于NCBI)

牡蛎FUT2基因相关序列偏多较多，与人类FUT2基因同源性较差。之前有学者通过克隆获得太平洋牡蛎(C. gigas)FUT2基因并提交NCBI数据库 [26]，在牡蛎基因组公布以后发现之前获得的牡蛎FUT2基因序列同牡蛎基因组FUT3序列同源性高达98%，而与牡蛎FUT2的同源性仅为36%，之前克隆的FUT2基因实际上应该是牡蛎FUT3基因。此外，目前尚无研究描述牡蛎FUT基因多态性相关报道。

牡蛎基因组个体间单核苷酸多态性差异往往表现的异常高，个体间差异达到2.3% [24]。我们比对分析后发现两种最主要的FUT2序列，两条序列在不同个体间分别都具有严格的保守性。我们推测可能FUT2基因在牡蛎中发生基因扩张现象，执行更加细致的生物学功能，这也从侧面反映FUT2基因在牡蛎识别NV中可能发挥重要作用。

总之，我们在FUT2保守区开发5个FUT2基因转录区SNP标记位点。我们开发的标记均在转录区内，可能会直接影响FUT2基因编码蛋白的功能，也可能会影响其基因的转录过程，从而影响牡蛎对NV的识别和富集作用，为进一步研究NV在生物体内的作用机制奠定良好基础。对进一步研究NV感染人体机理以及相应疫苗和药物的开发均有重要意义。

基金项目

本研究受到以下基金项目资助：国家自然科学基金(81600445)；广东省医学科学技术研究基金(A2016522)；广东医科大学科研基金(M2017009)；广东医科大学附属医院博士基金(BJ201512)。

文章引用

闫守泉,宋丽君,周玉兰,蒋华生,王家丰. 牡蛎富集诺如病毒相关FUT2基因单核苷酸多态性标记开发
Development of SNP Markers for Norovirus Related FUT2 Gene in Oyster[J]. 生物医学, 2019, 09(03): 135-142. https://doi.org/10.12677/HJBM.2019.93020

参考文献