ABSTRACT

Using pomegranate peel as raw material, based on single factor experiment, orthogonal experiments were used to optimize the extraction conditions of polyphenols from pomegranate peel. The polyphenols of the pomegranate peel were purified by the macroporous adsorption resin method. The color reaction and UV spectrum analysis were used. The purified pomegranate peel polyphenols were characterized, and the antioxidative properties of the pomegranate peel polyphenols obtained after purification were further studied. The experimental results showed that the optimal conditions for the extraction of polyphenols from pomegranate peel were as following: ethanol volume fraction 70%, solid-liquid ratio 1:30 (g/mL), extraction temperature 55˚C, extraction time 5 h, extraction rate 12.68%, and DM130 resin. The purified polyphenols from pomegranate peel had good effects, and the purity of the purified product was 90.56%. The purified product contained phenolic substances. The purified macroporous resin had good antioxidant activity.

Keywords:Pomegranate Peel, Polyphenols, Isolation and Purification, Antioxidant

石榴皮多酚的分离纯化及抗氧化性研究

黄戴纯，丘慧萍，罗文，徐国强，梁庆禄，邓红梅^*

广东石油化工学院环境与生物工程学院，广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心，广东普通高校食品科学创新团队，广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心，广东 茂名

收稿日期：2018年8月20日；录用日期：2018年9月6日；发布日期：2018年9月14日

摘 要

以石榴皮为原料，在单因素试验的基础上用正交试验优化石榴皮多酚提取的工艺条件，利用大孔吸附树脂对石榴皮多酚进行纯化，通过显色反应和紫外光谱分析对纯化后石榴皮多酚进行性质鉴定，并进一步研究了纯化后的石榴皮多酚的抗氧化性。结果表明：石榴皮多酚提取的最优工艺条件是乙醇体积分数70%、料液比1:30 (g/mL)、提取温度55℃、提取时间5 h，提取率为12.68%；DM130树脂纯化石榴皮多酚效果较好，纯化物纯度为90.56%；初步判断纯化物含有酚类物质；大孔吸附树脂纯化物抗氧化性作用较好。

关键词 :石榴皮，多酚，分离纯化，抗氧化性

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1. 引言

石榴(Punica granatum L.)又名若榴、丹若、天浆，是石榴科(Punicaceae)石榴属(Punica L.)植物，果实美观鲜艳、营养丰富 [1] 。目前，石榴最主要的消费途径是鲜食，或者被加工成果汁、果酱和果酒。石榴皮为石榴加工的副产物，往往被丢弃，不仅浪费资源，而且污染环境。有研究报道，石榴皮富含多酚类物质，在干皮中的质量分数约为10%~21% [2] 。多酚具有抗肿瘤活性，抑菌及抗病毒活性，抗心脑血管疾病的活性，抗氧化和延缓衰老活性等生理活性，近年来相关研究已经引起了国内外广泛的关注 [3] [4] [5] 。本实验将没有食用价值的石榴皮充分利用，从中提取得到具有生物活性、医用价值的多酚，达到变废为宝的目的，为石榴资源多元化、可持续发展提供理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 材料

材料：蒙自石榴。选用新鲜的石榴，取皮，并晒干，粉碎后在干燥避光条件下贮藏待用。

大孔吸附树脂：D101，DM130，AB-8，NKA-9，S-8。

试剂：无水乙醇、没食子酸、福林–酚试剂，Na₂CO₃，等均为分析纯。

仪器与设备：NRY-1102C立式恒温摇床(上海南荣实验室设备有限公司)；RE-3000真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DZF-6050真空冷冻干燥机(临海市永浩真空设备有限公司)；722N可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)等。

2.2. 方法

2.2.1. 石榴皮中多酚含量及提取率的测定

以没食子酸为标准品，采用福林酚法 [6] 检测石榴皮中多酚含量。以吸光值为纵坐标，没食子酸质量(mg)为横坐标，制作标准曲线，得回归方程：y = 0.1277 x + 0.0528 (R² = 0.9994)。根据标准曲线计算提取液中多酚含量及提取率。

2.2.2. 石榴皮多酚提取的单因素试验

石榴皮多酚提取的因素很多，本实验主要考察不同的乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)、提取时间(2 h、3 h、4 h、5 h、6 h)、提取温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)和料液比(1:15 g/mL、1:20 g/mL、1:25 g/mL、1:30 g/mL、1:35 g/mL) 4个因素对石榴皮多酚提取率的影响。

2.2.3. 石榴皮多酚提取条件的正交试验优化

为进一步优化提取工艺条件，以乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比为因素，石榴皮多酚提取率为考察指标，设计L₉ (3⁴)正交试验如表1所示。

2.2.4. 大孔吸附树脂纯化石榴皮多酚

1) 最佳树脂的筛选

选取D101、DM130、AB-8、NKA-9、S-8树脂，根据参考文献 [7] [8] 的方法进行预处理，以吸附率、解析率为指标，按下面公式计算，筛选出分离纯化石榴皮多酚类化合物性能最好的树脂。

$吸附量\left(mg/g\right)=\left[\left({\rho }_0-\rho e\right)\times V_0\right]/m$ $吸附率\left(\%\right)=\left({\rho }_0-\rho e\right)\times 100/{\rho }_0$

$解吸率\left(\%\right)=\rho d\times 100\%/\left({\rho }_0-\rho e\right)$ $回收率\left(\%\right)=\rho d\times 100\%/{\rho }_0$

式中：ρ₀为提取物溶液中多酚质量浓度，mg/mL；V₀为提取物溶液体积，mL；m为树脂质量，g。

2) DM130树脂对石榴皮多酚的动态吸附与解吸

参考文献 [8] 的方法，以流出体积为横坐标，流出液的吸光值为纵坐标，绘制动态吸附曲线和洗脱曲线，确定最佳上样量和乙醇洗脱剂的用量。

3) DM130树脂纯化后石榴皮多酚的含量测定

按筛选出的较优条件分别对石榴皮多酚的粗提液进行纯化后，用旋转蒸发器在50℃下旋转蒸发，除去解析液中的乙醇，再真空冷冻干燥除去水分，得到纯化后的多酚干粉，按照以下公式计算纯度。

$纯化物纯度\left(\%\right)=\frac{纯化物粉末中的多酚含量}{纯化物粉末质量}\times 100\%$

2.2.5. 石榴皮多酚物质初步鉴定

1) 多酚的紫外光谱分析

将石榴皮多酚粗提物和纯化物用甲醇溶解。在200~400 nm波长范围内扫描器紫外可见光谱。

2) 特征显色反应

分别称取0.2 g石榴皮多酚粗提物4份，放入4支试管(编号为1~4号)，向试管1中加入10%氢氧化钠溶液，试管2中加入香兰素 + 盐酸，观察其显色反应，以确定酚羟基的存在；向试管3中加入硫酸，向试管4中加入锌粉 + 盐酸进行显色反应，确定黄酮类物质的存在。纯化的石榴皮多酚的显色反应操作步骤同上。

2.2.6. 石榴皮多酚的抗氧化性研究

1) 石榴皮多酚对DPPH自由基清除实验

试样体系溶液的配制：取6支棕色比色管，依次加入0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的石榴皮多酚溶液，然后各加入0.1 g/mL DPPH溶液0.5 mL，最后用无水乙醇溶液定容至2.5 mL；标准体系溶液配制

表1. 正交实验因素和水平

方法相同，但样品溶液改为无水乙醇；对照样品VC₁配制方法相同，但样品溶液改成0.004 mg/mL的VC₁溶液。各溶液在517 nm处测定吸光值后按如下公式计算。

$DPPH自由基清除率\left(\%\right)=\frac{A_{标准}-A_{样品}}{A_{标准}}\times 100\%$

2) 石榴皮多酚对羟基的清除实验

试样体系：取6支棕色比色管(0~5号)，分别向6支比色管中依次加入3 mL 0.6 mg/mL的FeSO₄溶液、3 mL 4 mg/mL的H₂O₂溶液、2 mL 0.9 mg/mL的水杨酸溶液。其中0号比色管在38℃水浴加热20 min后，在510 nm波长下测定吸光值X₁，1~5号试管按顺序加入0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的石榴皮多酚溶液，然后分别用去离子水定容至10 mL振荡摇匀后38℃水浴加热20 min，在510 nm波长下测定吸光值X₂。

标准体系溶液：用等体积去离子水代替H₂O₂加入体系中反应，在510 nm波长下测定吸光值X₃；

对照品VC₂：与样品反应体系配制方法相同，但试样溶液改为0.2 mg/mL的VC₂溶液。羟基的自由基清除率用如下公式计算：

$羟基自由基清除率\left(\%\right)=\frac{X_1-\left(X_2-X_3\right)}{X_1}\times 100\%$

2.2.7. 数据分析方法

文中图使用Excel软件，正交试验使用正交设计助手和IBM SPSS 22.0软件。

3. 结果与讨论

3.1. 单因素实验结果

乙醇体积分数、提取温度、提取时间和料液比对石榴皮多酚提取率的影响如图1所示。

由图1可知，乙醇体积分数为70%时，多酚的提取率最大，为9.86%，提取温度在55℃左右提取率维持在9.73%左右；当提取时间为4 h时多酚的提取率为9.86%，料液比为1:20 (g/mL)时，多酚提取率最大。四个因素对石榴皮多酚提取率的影响较明显。因此可确定正交试验的因素和水平。

3.2. 最佳工艺条件的确定

正交试验结果如表2所示。

使用SPSS 22.0进行方差分析，结果如表3所示。

由表2极差分析可见，影响提取的因素大小为：料液比 > 提取时间 > 乙醇体积分数 > 提取温度，最佳提取条件为A₃B₃C₃D₃时即乙醇体积分数80%、提取温度60℃、料液比1:30 (g/ mL)、提取时间5 h。

从表3方差分析可知，料液比和提取时间对石榴皮多酚的提取影响显著，乙醇体积分数和提取温度

图1. 不同因素对石榴皮多酚提取率的影响

表2. 石榴皮多酚提取工艺的正交实验设计及结果

表3. 石榴皮多酚提取的正交试验的方差分析

a. R² = 0.995 (调整的R² = 0.979)；*表示差异显著；**表示差异极显著。

对石榴皮多酚的提取影响不显著。为了节约成本，确定石榴皮多酚的提取的最佳组合为A₂B₂C₃D₃即乙醇体积分数70%、提取温度55℃、料液比1:30 (g/mL)、提取时间5 h。在最佳组合提取条件下，进行三次重复验证试验，得石榴皮多酚提取率为12.68%。

3.3. 树脂的筛选

5种树脂对石榴皮多酚对石榴皮粗提取液总多酚的吸附量、吸附率、解析率以及回收率见表4。

由表4看出DM130具有最高的吸附率和解析率分别为85.00%、71.93%，回收率是75%，相比其他几种的大孔树脂都高，这可能与它本身较高的比表面积和较小的孔径以及合适的表面积结构有关，所以选定 DM130分离和纯化石榴皮多酚。

3.4. 大孔吸附树脂动态吸附与解析

当流出液的多酚质量浓度ρf (mg/mL)达到其上样液的10%时即认为多酚已达泄露点。以ρf对流出液体积(V)作图，同一浓度的上样液以2 BV/h流速上柱后的动态吸附曲线见图2。

由图2可知，上样量从2 BV时开始有较大幅度的多酚泄露，之后随着上样量的不断增大，泄漏量也逐渐增加，到了10 BV之后，流出液的多酚浓度(0.25 mg/mL)已经超过上样液(2 mg/mL)的10%浓度了，即已达到泄漏点。达到12 BV，上样完毕。一般而言，上样量越小，流出液多酚浓度就越低，吸附率会越高，上样量多会导致纯化周期延长，使效率降低 [9] [10] 。综合考虑，5 g树脂选择上样量为12 BV是适宜的。

由图3可知，当70%乙醇洗脱剂的用量为1 BV时，多酚的解析量不大，此时洗脱剂中的多酚浓度为0.41 mg/mL，随后洗脱剂的用量逐渐增加，多酚浓度也逐渐增大，在洗脱剂用量为3 BV时，洗脱剂中的多酚含量是最大的，为40.17 mg/mL。绝大部分的多酚在洗脱剂的用量为5 BV时洗脱下来，所以乙醇洗脱剂的用量为5 BV。

表4. 5种大孔吸附树脂静态吸附性能

图2. 石榴皮多酚吸附曲线

图3. 石榴皮多酚解析曲线

纯化后石榴皮多酚纯度是90.56%，比纯化前的20.58%提高了69.98%。可见，采用大孔吸附树脂纯化效果较好。

3.5. 多酚的性质鉴定

3.5.1. 特征颜色反应

分别取石榴皮粗提物(样品1)和大孔吸附树脂纯化物(样品2)，加入显色剂，通过观察颜色变化对样品定性分析。实验结果如表5所示。

由表5可见石榴皮粗提物和多酚纯化物里面都含有黄酮类物质的结构特征C_6¯C_3¯C₆，此外也都含有酚羟基，所以初步判断提取物及纯化物中都含有多酚类物质。

3.5.2. 紫外光谱分析

在200~400 nm波长范围内扫描器紫外可见光谱，结果如图4所示。

由图4可见，石榴皮粗提物、大孔吸附树脂纯化物在260 nm处都具有吸收峰，符合多酚类物质苯甲酰结构紫外光谱吸收特点。在300~400 nm间也有吸收峰，但紫外吸收不明显，这说明黄酮类化合物I带吸收弱，表明含有少量的黄酮类物质。

3.6. 石榴皮多酚的抗氧化性分析

3.6.1. 对DPPH的清除作用

石榴皮多酚粗提物和多酚纯化物和对DPPH自由基清除作用见图5。由图5可知，石榴皮多酚粗提物和多酚纯化物在一定范围内随着质量的提高，清除自由基的能力也逐渐增强，其剂量效应整体呈较好的直线关系，图中显示多酚纯化物的自由基清除率为14%~51%左右，维生素C的清除率在25%~59%，二者相差不大，多酚粗提物的自由基清除率表现为最低，这与时双千 [10] 的结果相似。说明石榴皮多酚具有较强的自由基清除能力，即具有较好的抗氧化性。

3.6.2. 对羟自由基的清除能力

石榴皮多酚粗提物和多酚纯化物和对羟基清除作用见图6。由图6可知，石榴皮多酚粗提物和多酚纯化物在一定范围内随着质量的提高，对羟自由基清除作用也逐渐增强，多酚纯化物对羟自由基清除率为20%~25%，多酚粗提物的最差，为13%~18%。维生素C的羟基清除率明显高于石榴皮多酚的清除率，说明石榴皮多酚对羟自由基的清除率不如维生素C效果好。

4. 结论

1) 石榴皮多酚的优化提取条件为：乙醇体积分数70%、提取温度55℃、料液比1:30 (g/mL)、提取时间5 h，在此条件下石榴皮多酚提取率为12.68%。

表5. 特征颜色反应

图4. 纯化前后石榴皮多酚紫外扫描图

图5. 石榴皮多酚对DPPH自由基的清除率

图6. 石榴皮多酚对羟自由基的清除率

2) DM130树脂是试验的5种大孔吸附树脂中分离纯化石榴皮多酚效果最好的，其纯化石榴皮多酚最佳条件为：上样量为12 BV，70%乙醇洗脱剂用量为5 BV，大孔吸附树脂纯化后的纯度为90.56%，比纯化前的20.58%提高了69.98%。

3) 显色反应和紫外光谱扫描结果分析都表明，石榴皮粗提物和纯化物里面含有黄酮类物质的结构特征C_6¯C_3¯C₆，此外也都含有酚羟基，所以初步判断提取物及纯化物中都含有多酚类物质。

4) 在抗氧化性方面，纯化后的石榴皮多酚对DPPH自由基和羟基的清除率比石榴皮多酚粗提物效果好。

基金项目

广东省岭南特色果蔬加工关键技术及应用工程技术研究中心项目（粤科函产学研字[2015]1487号）；广东普通高校食品科学创新团队项目（2016KCXTD020）；广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心（2012gczxB001）；广东石油化工学院大学生创新创业项目（201711656036）；广东石油化工学院“教学质量与教学改革工程”建设项目（广油教（2017）19号）。

文章引用

黄戴纯,丘慧萍,罗文,徐国强,梁庆禄,邓红梅. 石榴皮多酚的分离纯化及抗氧化性研究
Research on Separation, Purification and Antioxidation of Polyphenols from Pomegranate Peel[J]. 植物学研究, 2018, 07(05): 514-522. https://doi.org/10.12677/BR.2018.75062

参考文献