International Journal of Ecology
Vol.07 No.01(2018), Article ID:23877,8 pages
10.12677/IJE.2018.71005

Isolation and Identification Cultivable Microbes from the Antarctic Krill (Euphausia superba) and Other Antarctic Samples

Lingzhi Li1,2, Xiaoqing Tian2,3*, Yingying Tang2, Chengqi Fan1,2, Yanan Lu1,2

1Key Laboratory of Oceanic and Polar Fisheries, Ministry of Agriculture, Shanghai

2East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai

3Key Laboratory of East China Sea Fishery Resources Exploitation, Ministry of Agriculture, Shanghai

Received: Feb. 7th, 2018; accepted: Feb. 21st, 2018; published: Feb. 28th, 2018

ABSTRACT

In order to explore the diversity of cultivable microbes from the Antarctic krill (Euphausia superba) and other Antarctic organisms, different samples, including holothurians, sponges, corals, squids, asteroideans, sea urchins and sediment, were collected in the 33rd Chinese Antarctic scientific expedition. Bacteria and fungus from samples were identified by 16S rDNA and themicrobes from the Antarctic krill were analyzed by high-throughput sequencing technology. Ultimately, a total of 21 strains of bacteria were isolated according to the colony characteristics, such as size, color, shape. No fungi were found which maybe because the samples were stored for too long time. Among them, there were 3 phylum 12 genera of 14 bacteria strains, including the Proteobacteria 4 strains, Firmicutes 8 strains and Actinobacteria 2 strains. The majority of Firmicutes was Bacillus sp. which has 6 strains. The similarity of 14 strains of bacteria was more than 98% according to the NCBI Blast retrieval system which show they were known strains. At the same time, the result of high-throughput sequencing on the Antarctic krill which were kept in the RNA preservation solution was not obtained. The study shows that there were abundant of microorganism in Antarctic, and that can survive in ordinary environments. At the same time, cultivable microbial species which were obtained by framework trawl were enriched. This paper laid a basis for study of polar microorganism resources utilization.

Keywords:Euphausia superb, Cultivable Microorganism, 16S rDNA, Framework Trawl

南极大磷虾等南极不同样品来源的可培养微生物的分离鉴定

李灵智1,2,田晓清2,3*,唐莹莹2,樊成奇1,2,陆亚男1,2

1农业部远洋与极地渔业创新重点实验室,上海

2中国水产科学研究院东海水产研究所,上海

3农业部东海渔业资源开发利用重点实验室,上海

收稿日期:2018年2月7日;录用日期:2018年2月21日;发布日期:2018年2月28日

摘 要

为了探索南极大磷虾等南极不同生物来源可培养微生物的多样性。本研究对中国第33次南极科学考察采集的多个站位的南极大磷虾,以及海参、海绵、珊瑚、鱿鱼、海星、海胆、底泥等样品进行了细菌、真菌的分离培养,然后进一步开展16S rDNA鉴定和高通量测序分析。最终根据菌落大小、颜色、形态等特征的不同,共分离获得21株细菌,并未分离到真菌,可能样品保藏时间过久的原因。经鉴定得到3个门12个属的14株细菌,其中变形菌门(Proteobacteria) 4株,厚壁菌门(Firmicutes) 8株,放线菌门(Actinobacteria) 2株。厚壁菌门(Firmicutes)中属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)最多,有6株。通过NCBI的Blast检索系统比对,发现14株细菌的相似度均达到98%以上,推测这14株都是已知种属。同时,对RNA保存液保存的各个站点采集到的南极大磷虾中的微生物进行了高通量测序,遗憾没有得出结论。本次研究显示,南极地区具有丰富的微生物资源,并且大部分微生物也可以在普通环境生存。同时,丰富了框架拖网的生物来源的共附生可培养微生物的种类,为极地微生物资源的利用研究奠定了基础。

关键词 :南极大磷虾,可培养微生物,16S rDNA,框架拖网

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1. 引言

南极位于地球的最南端,由陆地和海洋两部分构成,除在短暂的夏季部分地区有冰雪融化以外,其余地区终年被冰雪覆盖,气候酷寒干燥、强光辐射,是地球上最冷最干的地区 [1] [2] 。由于南极地区的特殊自然环境,使生存于其中的微生物必然具有其特殊的生理特点和化学多样性 [3] ,因此各国的微生物学家相继在极地进行了大量的研究工作,证明了极地微生物在基础研究和开发应用方面具有广阔的前景。我国自行组建的极地微生物学调研起始于上世纪80年代初,迄今30余年来,中国极地微生物学研究取得了丰硕的成果,在土壤、空气、水体等中分离鉴定到假单胞菌、链霉菌、青霉菌等多种原核或真核的微生物菌株 [4] 。这些菌株代谢产物发现具有抗肿瘤 [5] 、杀虫 [6] 、多种酶活活性 [7] [8] 等。南极大磷虾(Euphausia superba),是一种生活在南极洲水域的海洋浮游甲壳类生物,资源丰富,据统计全球资源总量至少有6.5~10亿吨 [9] 。对于当前国内外海洋生物资源,尤其是传统海洋生物资源日趋衰退,如何有效、充分得利用这一丰富的海洋生物资源,是摆在目前的首要问题。我国学者利用高通量测序的手段,分析了2015年6月采集的冷冻南极磷虾中细菌菌群结构,发现可培养细菌仅占总细菌菌群的1.10% [10] ;而本团队在南极磷虾中分离得到假单胞菌 [11] ,利用LCTOF MS测试分析发现具有很好的化学多样性;南极普里兹湾的沉积物中分离得到的4株真菌也具有很好地的蛋白磷酸酶活性,这在细胞内的信号转导、细胞循环、次生代谢产物及底物的转化过程中起着非常重要的作用 [3] 。因此,南极地区被认为是个潜在、重要的微生物资源库,可能是产生新型生物活性物质和先导化合物菌株的潜在种源地 [12] 。

本次研究选择中国第33次南极科学考察船框架拖网的以南极大磷虾为主的渔获物为研究目标,进行了细菌和真菌的分离培养,并通过16S rDNA鉴定分析和菌落大小、颜色、形态等特征鉴定获得微生物。通过本次研究丰富了框架拖网获得的南极大磷虾等生物来源的共附生可培养微生物的种类,为极地微生物资源的利用研究奠定了基础。

2. 实验材料与方法

2.1. 样品采集站位信息

本文样品的采集由2017年4月的第33次南极考察船采用框架拖网的手段获得的,详细信息见表1图1为各个采样点分布图。南极大磷虾样品编号为站点编号,其他1号为红色海参,2号为黑色海绵,3号为黑色珊瑚,4号为灰色海绵,5号为灰色海绵,6号为灰色海绵,7号为鱿鱼,8号为粉红海星,9号为底泥,10号为海胆,11号为底泥。采集到的样品−20℃冷冻保存,其中南极大磷虾样品分别用甘油和RNA保存液保存;10号样品是甘油保存,其他的样品冰冻保存。

Table 1. The sampling point in the 33rd Chinese Antarctic scientific expedition

表1. 第33次南极科考期间采样点以及相关信息

Figure 1. Distribution of sampling points

图1. 采样点分布图

2.2. 分离培养基

1) 细菌培养基 [13]

2216E培养基:蛋白胨5 g,酵母粉1 g,琼脂18 g,陈海水1000 mL,121℃ (98.1 kPa)高压灭菌20 min,30℃培养7 d。

2) 真菌培养基 [14]

土豆培养基(PDA):土豆200 g,葡萄糖10 g,琼脂17 g,陈海水1000 mL,121℃下高压湿热灭菌20 min,28℃培养10 d。

察氏培养基:硝酸钠3 g,磷酸氢二钾1 g,硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5 g,氯化钾0.5 g,硫酸亚铁0.01 g,蔗糖30 g,琼脂20 g,陈海水1000 mL,加热溶解,分装后121℃灭菌20 min,28℃培养10 d。

马丁氏培养基:KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,琼脂15 g,陈海水1000 ml,28℃培养10 d。

真菌分离过程中分别加入抗生素:青霉素、链霉素、氯霉素各30 μg/ml。

2.3. 可培养菌株的筛选纯化及保种

1) 磷虾样品、海参、海绵、珊瑚、鱿鱼、海星、海胆:

用无菌水冲洗干净,再用无菌剪刀剪碎,用无菌海水稀释,将预处理后的样品悬液系列稀释至10−1、10−2、10−3、10−4、10−5,分别取100 μL涂布在各种培养基平板,细菌于30℃培养7 d,真菌于28℃培养10 d。然后,挑取不同颜色、形态的菌落进行划线纯化,最后获得纯种分别用对应的试管斜面保存于4℃冰箱和30%甘油菌液用冻干管保存于−80℃超低温冰箱备用。

2) 沉积物样品:

用无菌刀、勺刮去表层沉积物,用无菌海水系列稀释至10−1、10−2、10−3、10−4、10−5,分别取100 μL涂布在各种培养基平板,细菌于30℃培养7 d,真菌于28℃培养10 d。然后,根据菌落形态、色素、干燥等特征,挑取形态差异较大的菌株进行划线纯化。挑取纯化后的单菌落,分别在4℃下用培养基斜面和−80℃下用30%甘油保种。

2.4. 可培养共附生菌16SrDNA的鉴定

1) 细菌基因组DNA的制备:将已生长到对数期的斜面菌落,接种到5 mL 2216液体培养基中,置于摇床28℃培养3~5 d,根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤提取目标基因组DNA。

2) 引物设计:海洋细菌16S rDNA基因扩增选用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增 [15] 。

3) PCR扩增体系为50 Μl: 2 × Taq PCR MasterMix 25 μL,引物各1 μL,模板DNA 3 μL,重蒸水20 μL。扩增程序:94程序预变性5 min,94 n变性30 s,56 s退火30 s,72 s延伸1 min,共35个循环,最后72 s延伸10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

4) DNA测序:委托上海美吉生物公司完成测序。获得的16S rDNA基因序列提交GenBank用BLAST 软件与已知序列进行对比。

将菌株的16SrDNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列同源性分析。

2.5. 南极大磷虾中细菌菌群结构分析

RNA保存液保存的南极大磷虾样品,委托上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序分析。

3. 结果

3.1. 可培养菌株的分子鉴定

从第33次南极科考船带回来的生物样品中分离的微生物,根据菌落大小、颜色、形态等特征的不同,共分离获得21株细菌,并未分离到真菌,可能样品保藏时间过久的原因。分别进行16SrDNA鉴定,共鉴定得到3个门12个属的14株细菌,具体见表2。14株细菌中变形菌门(Proteobacteria) 4株,厚壁菌门(Firmicutes) 8株,放线菌门(Actinobacteria) 2株。厚壁菌门(Firmicutes)中属芽孢杆菌属最多,有6株。从DA-8和DA-13两个站点的南极大磷虾样品中分别获得微球菌属(Micrococcus) 1株和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas) 1株。部分细菌菌落图和显微照片(显微镜:上海光学仪器一厂,XSP-44X.9 型))见图2图3。一般16SrDNA序列相似性小于98%则可认为属于潜在新种,14株细菌的相似度均达到98%以上,推测这14株都是已知种属。

注:从左至右分别为1-1,1-3,2-1,2-4,2-5,4-1,10-4,DA-8细菌菌落图片。

Figure 2. Photos of Bacteria colony

图2. 部分细菌的菌落照片

注:a,b,c分别为菌株DA-8,DA-13,4-1在40倍下的照片,d,e,f分别为2-5,1-3,1-1经结晶紫染色后100倍下的照片。

Figure 3. Microphotographs of bacteria colony

图3. 部分细菌显微照片

Table 2. The identified result of cultivable bacteria

表2. 南极部分生物可培养细菌的分离鉴定

3.2. 不同生物来源的细菌分离的比较

本次研究在灰色海绵(4)、灰色海绵(5)和底泥(9)中各分离鉴定了1株细菌,南极磷虾中分离鉴定了2株细菌,红色海参(1)中分离鉴定了3株细菌,黑色海绵(2)和底泥(11)中分离鉴定的细菌种属最多,各4株,其他生物材料中未分离到可培养的微生物。

D2-4和DB-6两个采样点,分别分离得到8株和5株菌。这两个采样点,分别靠近南瑟德兰群岛和南奥克尼群岛。可能受人类生活影响比较大,分离得到菌落数多于其他采样点。

3.3. 南极大磷虾中细菌菌群结构分析

本次实验的委托检测机构-上海美吉生物医药科技有限公司,未得到南极大磷虾中细菌菌群结构分析的结果。

4. 讨论

本次研究在南极磷虾样品中仅分离鉴定了2株菌,分别为微球菌属(Micrococcus)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。另外,RNA保存液保存的样品,未得出高通量测序的结果。问题可能出在提取宏基因组DNA这个关键问题上 [16] :可尝试采用匀浆的方式把微生物分散到缓冲液中,再把匀浆液中的微生物通过过滤的方式分离出来。本团队 [17] 成员杨桥曾参加第29次极地科学考察,分离获得南极磷虾共附生微生物133株,其中7%为未知种。与之前报道的相比,在细菌门类水平方面存在差别。另外,在所有样品中真菌没有分离到,这可能是由样品处理的及时性、取样地点等因素造成的。本研究的样品均来自第33次南极科考的雪龙号,样品采集到实验室分离时间比较长,另一方面可以考虑在培养和分离的手段上继续改进。

近年来对样品中的微生物初步调查研究大多采用分子生物学技术,如高通量测序等,这种方法能够获取较为全面的微生物信息,而传统的人工培养方法因受到培养基成分和培养条件等限制而较少应用 [18] 。但是开发南极,利用南极的关键是获得可培养的功能菌株,所以传统培养方法获得的微生物不但能够反映生态环境特征的类群,可以更好地了解样品中处于活体状态的优势菌种类群 [19] ,还可以为开发利用南极微生物资源奠定基础。

基金项目

中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(2016HY-ZD0903)。

文章引用

李灵智,田晓清,唐莹莹,樊成奇,陆亚男. 南极大磷虾等南极不同样品来源的可培养微生物的分离鉴定
Isolation and Identification Cultivable Microbes from the Antarctic Krill (Euphausia superba) and Other Antarctic Samples[J]. 世界生态学, 2018, 07(01): 29-36. http://dx.doi.org/10.12677/IJE.2018.71005

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