ABSTRACT

In this study, the extraction technology of total polyphenols from Corhyceps flowers was optimized through single factor experiment and orthogonal experiment. Then, the extraction was washed by petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol. The effects of total polyphenols from different part in Corhyceps flowers on the scavenging of ABTS+ radicals, DPPH radicals and alpha-glucoside inhibition were also studied. The result shows that the factors effected the Gallic acid content are the ethanol extraction > extraction temperature > solid-liquid ratio > extraction time and the best craft is using solid-liquid ratio 1:25, the content of ethanol is 80%, extraction temperature is 80˚C, the extraction time is 1 h. The ethyl acetate fraction of Corhyceps flowers, a strong ability to act as antioxidant, might be considered as a natural source of active compounds.

Keywords:Cordyceps, Total Polyphenols, Extraction

虫草花多酚浸提工艺优化及抗氧化活性研究

朱屋彪^*，侯勇，庄晓梅

中山职业技术学院应用化学教研室，广东 中山

收稿日期：2017年11月10日；录用日期：2017年11月22日；发布日期：2017年11月29日

摘 要

本文研究虫草花多酚浸提最优工艺，通过单因素试验和正交试验结合，以总多酚含量为优化指标。然后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除、总抗氧化能力检测试剂盒法、α-葡萄糖苷酶活性抑制三种体外抗氧化测定方法进行抗氧化活性测试。试验表明，影响多酚含量的提取因素为乙醇含量 > 提取温度 > 液料比 > 浸泡时间；虫草花中总多酚提取的最佳工艺为：液料比1:25 (g/mL)，乙醇含量为80%，提取温度80℃，浸泡时间为1 h。虫草花的乙酸乙酯萃取物具有显著抗氧化活性，可以成为天然抗氧化活性化合物的良好来源。

关键词 :虫草花，总多酚，提取

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1. 引言

“吃在广东”，而广东又以老火靓汤最为出名，作为食材的虫草花目前的研究报道较少。虫草花又称北虫草、蛹虫草(Cordyceps militaris)，是人工培养的虫草子实体，属于一种真菌类(Fungi)，是运用现代生物工程技术开发出来的，可供人们食用和药用的菌类新品种。虫草花内含有虫草素、虫草酸、多酚、多糖、腺苷等多种活性物质，具有抗肿瘤、抗炎、提高免疫力等功效，民间常用于肺炎、肾虚、腰痛等疾病的治疗。当前，就虫草花活性成分提取工艺、抗氧化性、降糖活性的研究很少。我们以总多酚含量(没食子酸)为观察指标，探讨了虫草花活性成分浸提的最优工艺，为进一步开发虫草花资源提供理论依据。

2. 实验与方法

2.1. 试材

虫草花干500 g (广州市兴华干货，原产地广东江门新会)

2.2. 试材的处理方法

2.2.1. 试材前处理流程

将虫草花于干燥箱内60℃烘干，粉碎机粉碎，过200目筛。准确称量100 g粉末，按单因素和正交实验条件用80%乙醇溶液浸提，转速3000 rad/min离心处理，收集离心所得滤液为提取液。

2.2.2. 虫草花活性成分的粗提取方法

参考景临林等人，取上述1.2.1最后所得的多酚提取液于1000 mL的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪将其旋干，得到虫草花80%醇提部分 [1] 。提取物加5倍量的蒸馏水超声10 min得到悬浮液，将其移置250 mL分液漏斗中，依次用10 mL的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，合并各自萃取液并保留水相，用旋转蒸发仪分别将其旋干，得不同溶剂萃取物 [2] 。

2.3. 虫草花活性成分提取

2.3.1. 单因素试验设计

选取料液比、乙醇含量、提取温度和浸泡时间4个可能影响提取效果的因素，以总多酚含量为考察指标进行单因素试验，以确定相关因素及各因素的适宜范围，见表1。

表1. 单因素试验因素水平表

2.3.2. 正交试验设计

根据单因素试验确定的范围，选定料液比、提取温度、乙醇含 、浸泡时间4个主要影响因素进行正交试验以考察最佳提取工艺条件，见表2。

表2. 正交试验因素水平表

2.3.3. 虫草花活性成分含量计算

1) 没食子酸标准曲线的制作

参考欧阳玉祝等人文献，准确称取2.4 mg没食子酸标准品于25 mL容量瓶中，用移液枪移取24 mL蒸馏水至容量瓶中，震荡摇匀，配成0.1 mg/mL的标准液，分别吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL没食子酸标准液于6支试管中，再分别滴加5.0、4.0、3.0、2.0、1.0和0.0 mL蒸馏水，2 mL酒石酸亚铁溶液，2 mL pH = 7.5的缓冲溶液，混匀静置20 min，以不含没食子酸标准液的溶液代替标准溶液作空白对照，用紫外可见分光光度计于波长540 nm处测各种标准溶液的吸光度 [3] 。

2) 虫草花多活性组分总多酚含量计算

按照标准曲线计算出虫草花中总多酚质量浓度(C, mg∙mL⁻¹)，按以下公式计算样品中总多酚含量W(mg∙g⁻¹)：

总多酚含量W = CV/m，

式中：W为虫草花中总多酚含量(mg∙g⁻¹)；C为虫草花多酚质量浓度(mg∙mL⁻¹)；V为体积(mL)；m为虫草花粉末质量(g)。

3) 测定方法：① 取不同组分的浸膏0.045 g，用7 mL 80%乙醇将其溶解于试管中。配制成相同浓度的虫草花萃取物。从试管中取2 mL上述萃取物与另一支试管中。加入2 mL酒石酸亚铁溶液，2 mL pH = 7.5的缓冲溶液，混匀静置20 min，以不含没食子酸标准液的溶液代替标准溶液作空白对照，用紫外可见分光光度计于波长 540 nm 处测各种标准溶液的吸光度。

② 取1.2.1流程最后得到的提取液2 mL，加入2 mL酒石酸亚铁溶液，2 mL pH = 7.5的缓冲溶液，混匀静置20 min，以不含没食子酸标准液的溶液代替标准溶液作空白对照，用紫外可见分光光度计于波长540 nm处测各组标准溶液的吸光度。

2.3.4. 虫草花不同溶剂提取部分活性成分比较

取1.2.2所得的不同溶剂萃取物，对各个成分之间采用DPPH、ABTS、α-葡萄糖苷酶三种体外抗氧化测定方法进行活性测试 [4] [5] [6] [7] 。

3. 实验结果与讨论

3.1. 虫草花活性成分提取物

按1.2.2所述方法，依次80%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同溶剂萃取物，结果如表3所示，平行测定三次结果。

表3. 虫草花活性成分提取物列表

3.2. 虫草花没食子酸标准曲线结果

以吸光度(A)为横坐标，以没食子酸含量(mg∙mL⁻¹)为纵坐标绘图，结果进行线性回归得回归方程：Y = 22.136x − 0.1277(R² = 0.9982)。标准曲线图1表明，没食子酸在质量浓度为0.01~0.06 mg∙mL⁻¹区间有良好的线性关系。

图1. 没食子酸标准曲线

3.3. 提取条件对虫草花多酚提取效果的影响

3.3.1. 料液比对总多酚提取效果的影响

浸泡时间2 h，乙醇含量60%，提取温度80℃，由图2可知，总多酚提取率随料液比的增大而先增大后降低，最佳提取的料液比为1:20，1:15，1:25的提取率也较高。这可能是因为料液比为1:20时，溶剂对多酚的溶解已基本达到饱和，继续增加溶剂用量，并不能显著提高多酚的提取量。而料液比越大，在浓缩过程中消耗的时间越长，多酚被氧化的可能性提高，同时也加大了浓缩时的能量消耗，不利于总多酚的提取，因此将正交试验中的料液比分别定为1:15、1:20和1:25。

图2. 料液比对总多酚提取效果的影响

3.3.2. 乙醇含量对总多酚提取效果的影响

浸泡时间2 h，料液比为1:20，提取温度80℃的提取。由图3可知，总多酚提取率随乙醇含量的增大而先增大后降低，最佳提取的乙醇含量为70%，60%，80%的提取率也较高。这可能是因为乙醇含量为80%时，乙醇含量过高，会将其他杂质也提取出来，不利于总多酚的提取，因此将正交试验中的乙醇含量分别定为60%、70%和80%。

图3. 乙醇含量对总多酚提取效果的影响

3.3.3. 提取温度对总多酚提取效果的影响

浸泡时间2 h，乙醇含量60%，料液比1:20的提取结果。由图4可知，总多酚提取率随温度的升高而先增大后降低，当温度超过70℃后，总多酚质量浓度下降。最佳提取的提取温度为70℃。50℃，60℃的提取率也较高。从中可推测影响提取率原因是：当提取温度超过60%乙醇的沸点时，溶液剧烈沸腾产生的气泡使原料粉末黏附于容器壁上，导致原料未能充分被溶剂浸提；另外也可能是由于提取温度过高造成多酚分子的结构破坏。因此将正交试验中的提取温度分别定为60℃、70℃和80℃。

图4. 提取温度对总多酚提取效果的影响

3.3.4. 浸泡时间对总多酚提取效果的影响

料液比1:20，乙醇含量60%，提取温度80℃的提取结果。由图5可知，总多酚提取率随浸泡时间的增加而先增大后降低，当浸泡时间为1.5小时时总多酚质量浓度最大，之后随浸泡时间的继续增加，总多酚质量浓度呈下降趋势，因此最佳提取的时间为1.5 h。2 h的提取率也较高。这可能是因为浸泡时间越长，多酚被氧化的可能性提高，乙醇含量也对多酚的分子结构，不利于总多酚的提取，因此将正交试验中的浸泡时间分别定为1 h、1.5 h和2 h。

图5. 浸泡时间对总多酚提取效果的影响

3.4. 正交试验结果

正交试验结果见表4，从表4分析可知：各因素对虫草花总多酚产率的影响程度不同，其影响的主次顺序为：B(乙醇含量) > C(提取温度) > A(料液比) > D(浸泡时间)。由试验数据可以得出：乙醇含量为显著影响因素，极差分析最优组合是A₃B₃C₃D₁，最佳提取工艺条件为：料液比1:25 (g/mL)，乙醇含量为80％，提取温度80℃，浸泡时间为1 h。

表4. 正交实验结果

3.5. 虫草花多活性组分总多酚含量计算结果

样品中的多酚含量由没食子酸标准曲线：Y = 22.131x − 0.1283(R² = 0.99735)换算得来，① 各提取物部位多酚含量如表5所示：80%醇提物中多酚类化合物含量最高4.7817 mg∙g⁻¹，然后依次是水萃取物、石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物，分别是3.8891 mg∙g⁻¹、3.8680 mg∙g⁻¹和3.4744 mg∙g⁻¹。正丁醇萃取物多酚含量最低，仅为2.8769 mg∙g⁻¹。各活性组分总多酚含量的大小排序为：80%醇提物 > 水萃取物 > 石油醚萃取物 > 乙酸乙酯萃取物 > 正丁醇萃取物。

② 测得虫草花提取液中总多酚的平均质量浓度是0.8382 mg∙g⁻¹。

表5. 虫草花乙醇提取物不同溶剂萃取物中总酚含量测定(mg∙g⁻1)

3.6. 虫草花不同溶剂提取物活性测试计算结果

由表6可知，对DPPH自由基的清除作用，不同极性部位清除DPPH自由基的能力顺序为：乙酸乙酯萃取物 > 正丁醇萃取物 > 石油醚萃取物 > 水萃取物 > 80%醇提物。对ABTS自由基的清除作用不同极性部位清除ABTS+·自由基的能力顺序为：乙酸乙酯萃取物 > 正丁醇萃取物 > 80%醇提物 > 石油醚萃取物 > 水萃取物。对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用乙酸乙酯部分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最强，然后依次是80%醇提物部分 > 石油醚部分 > 剩余水相部分 > 正丁醇部分。

表6. 虫草花不同溶剂萃取物活性成分

4. 结论与讨论

由虫草花多酚提取条件的研究可知，各因素对虫草花多酚提取得率的影响次序是：乙醇含量 > 提取温度 > 料液比 > 浸泡时间。从成本角度考虑，最佳提取工艺为：乙醇含量80%，提取温度80℃，浸泡时间60 min，料液比1:25 (g/mL)，在以上最优条件下虫草花多酚提取物中多酚含量为51.23%。

多酚类化合物大多具有酚羟基，易溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂，乙醇溶解性能较好，对植物细胞的穿透能力较强，与甲醇相比，具有毒性小、来源方便等特点，故试验选择乙醇作为提取溶剂。单因素及正交试验结果表明，不同提取因素对虫草花多酚提取效果的影响很大，各因素对其多酚提取效果的影响由大到小依次为乙醇含量、提取温度、料液比、浸泡时间。优化的最佳提取工艺为乙醇体积分数80%，料液比1:25 (g/mL)，浸泡时间为60 min，提取温度80℃。在此条件下进行重复性试验，测得多酚提取物中多酚含量为51.23%。该方法操作简单准确度高，环境污染小，可作为虫草花中多酚的提取和含量测定。

该研究采用体外模型从ABTS+•自由基和DPPH自由基(DPPH•)的清除能力及α-葡萄糖苷酶活性抑制率等角度评价其活性。虫草花中多酚类化合物对DPPH•和ABTS+•的清除率分别可达88.73%和84.71%，α-葡萄糖苷酶活性的IC₅₀为60 μg/mL，说明虫草花中含有多酚类化合物，具有较好的抗氧化功能，是一种具有较大开发价值的药食同源食用菌 [6] [7] 。

基金项目

中山市科技局项目(2015syf0202)。

文章引用

朱屋彪,侯 勇,庄晓梅. 虫草花多酚浸提工艺优化及抗氧化活性研究
Optimization of Extraction Technology of Total Polyphenols in Corhyceps Flowers and the Antioxidant Effects[J]. 分析化学进展, 2017, 07(04): 240-248. http://dx.doi.org/10.12677/AAC.2017.74032

参考文献 (References)