ABSTRACT

In the present work, a selective and sensitive method for detecting tetracycline hydrochloride (TC) using manganese doped carbon quantum dots (Mn-CDs) was developed. The Mn-CDs were prepared via a simple hydrothermal method using 1-(2-pyridinylazo)-2-naphthalenol (PAN) and MnCl₂ as precursors. Because of the strong characteristic absorption of TC at 360 nm, which has good spectral overlap with the emission peak of Mn-CDs, the fluorescence intensity of Mn-CDs at 360 nm was linearly quenched in the presence of TC in the concentration range of 1 - 200 µM. The developing assay based on an inner filter effect (IFE) mechanism for detecting TC is selective, convenient, and shows that the as-prepared Mn-CDs have application prospects for simple and specific analytical chemistry.

Keywords:Carbon Dots, Inner Filter Effect, Tetracycline Hydrochloride, Food Samples

基于内滤效应的碳量子点荧光探针测定食品中盐酸四环素

郑彬，张兰兰，胡冰倩，雷雯，严民民，柳金枝，李清媛，黄飞宏，孙巍巍，向国强

河南工业大学化学化工学院，河南 郑州

收稿日期：2019年3月5日；录用日期：2019年3月19日；发布日期：2019年3月26日

摘 要

以1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(PAN)和MnCl₂为原料，通过水热法制备了Mn掺杂碳量子点(Mn-CDs)。所制备的Mn-CDs的发射光谱与四环素(TC)的吸收光谱有较好的重叠，当有TC存在的条件下，Mn-CDs的荧光强度(360 nm)被猝灭，且荧光猝灭的程度与TC的浓度(1~200 µM)呈线性关系。TC对Mn-CDs荧光猝灭的机理是内滤作用，所建立的分析方法具有较高的选择性，并成功应用于动物肉样品中TC的测定。

关键词 :碳量子点，内滤效应，盐酸四环素，食品样品

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1. 引言

四环素(Tetracycline, TC)是由放线菌属产生或半合成的一种广谱抗生素，对许多革兰氏阴性菌及阳性菌等具有很好的抗菌活性，在农畜牧业上广泛用于兽药和饲料添加剂 [1] 。其中盐酸四环素是四环素族中最常用的抗生素。近年来因其滥用而导致肉类和奶类食品中抗生素残留，并且造成了食品安全问题。研究表明，长期食用含有四环素残留的食品会导致人体出现过敏、致癌、过敏菌株等副作用 [2] 。因此很多国家已经限制使用四环素，并对动物源性食品中四环素的残留限量作了严格规定，美国FDA规定四环素在牛奶中的残留限量小于80 μg∙L⁻¹ [3] ；国际卫生组织和欧盟规定在牛奶中的最大残留限量为100 μg∙L⁻¹ [4] 。目前检测盐酸四环素的常用方法有：高效液相色谱法(HPLC) [5] [6] [7] 、荧光法 [8] 、酶联免疫法(ELISA) [9] 、表面等离子体共振法 [10] [11] 等一系列方法。虽然这些方法能够精确测量大多样品中抗生素的含量，但存在费力、费时、费钱，仪器设备昂贵，灵敏性差等问题。因此建立快速、简便、灵敏的四环素残留检测方法，对保障食品安全具有重要意义。

近年来，碳量子点(Carbon dots, CDs)由于优良的荧光性质和良好生物相容性，在荧光传感分析中受到了广泛关注 [12] [13] [14] [15] 。CDs不但保持了碳材料本身的绿色环保、原料广泛、易修饰、制备成本低等优良性能，同时又具备发光波长可调、光稳定性好、色饱和强度高、双光子吸收面积大等独有优势，因而在光电器件领域和生物探针、光催化、细胞成像、化学传感等领域展现出广泛的应用前景 [16] [17] [18] 。近年来，人们更重视开发非共价偶联的荧光传感体系。构建非共价偶联荧光传感体系的一个常用方法是内滤效应。内滤效应本是荧光分析法中一个内在的误差来源，但近年来基于该效应成功构建了许多荧光传感体系 [19] [20] [21] [22] 。利用内滤效应构建荧光传感体系需要吸光体和荧光体两种光活性物质，若吸光体的吸收光谱和荧光体的激发或发射光谱有效重叠，则吸光体可以调节荧光体的荧光发射光谱。该法由于将吸光体的吸收信号转变为荧光信号，从而显著提高了方法的灵敏度。

基于荧光内滤效应，以四环素为吸光体、Mn掺杂碳量子点为荧光体构建非共价偶联荧光传感体系，建立了一种测定食品中盐酸四环素的荧光分析法。该方法操作简单、选择性好、灵敏度高，已成功应用于实际样品的检测。

2. 实验部分

2.1. 试剂和仪器

SHIMADZU RF-6000荧光光谱仪(SHIMADZU，日本)；透射电镜仪(JEM-2011，日本)；电子天平(BS224S，上海赛多利斯天平公司)；pH计(PHS-3C，上海精密科学仪器公司)。

1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(PAN)，盐酸四环素(AR, Aladdin)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA，AR，国药集团化学试剂有限公司)，三氯乙酸(AR，国药集团化学试剂有限公司)；各种金属盐均购于Aladdin公司，均为分析纯(AR)或更高纯度实验用水为二次蒸馏水。

2.2. Mn掺杂碳量子点(Mn-CDs)的制备

参考文献 [23] 的方法制备Mn掺杂碳量子点(Mn-CDs)，将PAN (49.8 mg)和MnCl₂ (79.2 mg)加入到10 mL无水乙醇中，搅拌混匀后转移到水热反应釜(60 mL)，将反应釜置于烘箱中反应(180℃, 4 h)。反应结束后，自然冷却至室温，向所得溶液中加入超纯水(20 mL)，通过离心分离(11,000 rpm, 30 min)，去除不溶物。所得的水溶液经过冷冻干燥后，即得到Mn-CDs粉末。采用同样的方法，在上述制备过程中不加人MnCl₂则可得到未掺杂Mn的碳量子点(PCDs)粉末。所制备的Mn-CDs和PCDs粉末重新分散到超纯水中，分别得到浓度为0.25 g∙L⁻¹的溶液用于后续实验。

2.3. 实验方法

在10 mL的具塞刻度试管里依次加入1.0 mL Mn-CDs (0.25 g∙L⁻¹)溶液、5.0 mLB-R缓冲液(pH 6.0)和一定体积的盐酸四环素标准溶液(或样品溶液)，用超纯水定容至刻度并摇匀。在激发波长300 nm条件下(激发和发射狭缝均为10 nm)，分别测定空白溶液(不加人盐酸四环素或样品溶液)和测试溶液(加入TC)在发射波长360 nm处的荧光强度(分别用I₀和I表示)。计算lg(I₀/I)。

2.4. 样品处理

本实验所用动物肉样品(鸡肉，鲫鱼肉，鸭肉)，均购于当地超市(郑州，中原区)。分别称取出5.0 g粉碎样品，置于具塞聚丙烯离心管中，加入20 mL的0.1 mol∙L⁻¹ Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH 4.0)，振荡20 min，高速离心(10000 rpm、20 min)，用 0.22 μm滤膜过滤，收集滤液待测。

3. 结果与讨论

3.1. Mn-CDs的表征

图1(a)给出了所制备的Mn-CDs的TEM图。由图1(a)可以看出，制备的Mn-CDs近似球形，窄粒径分布和较好的分散性。采用FT-IR对所制备的Mn-CDs和PCDs进行了表征，结果如图1(b)所示。从图1(b)可以看出，与PCDs的FT-IR图相比，Mn-CDs的FT-IR图中一些典型的官能团的吸收峰(如C=N，吡啶C-H，C=C)明显减弱，这可能是由于Mn离子与吡啶N配位结合所导致。

3.2. Mn-CDs的光谱性质

图2(a)为Mn-CDs和PCDs的紫外–可见吸收光谱图，从图可以看出，PCDs的吸收峰位于290 nm处，而Mn-CDs的吸收峰略有红移，达到300 nm。289 nm是n-π*跃迁的典型吸收带，Mn-CDs的吸收峰红移可能是由于Mn···O配位键的形成。图2(b)和图2(c)是Mn-CDs的荧光光谱图，在不同的激发波长(图2(b)，250~350 nm，图2(c) 350~410 nm)条件下，荧光发射峰从330 nm红移至460 nm，表现出明显的激发波长依赖性。当激发波长为300 nm时，Mn-CDs在360 nm处有最大荧光发射峰。以硫酸喹啉(0.05 M，激发波长为360 nm，荧光量子效率为0.54)为参考标准，测得Mn-CDs的荧光量子效率为0.83。

同时也考察了pH对Mn-CDs的荧光强度的影响，结果如图2(d)所示。从图可以看出，Mn-CDs在酸性条件下的荧光强度明显强于碱性条件下的荧光强度，在pH 2~4和pH 7~11范围内，Mn-CDs的荧光强度基本保持不变。

图1. Mn掺杂碳量子点(Mn-CDs)的表征((a) TEM；(b) Mn-CDs和PCDs的FT-IR光谱图)

图2. (a) Mn-CDs和PCDs的紫外–可见吸收光谱。Mn-CDs的荧光发射光谱；(b) 激发波长范围250~350 nm和(c) 激发波长范围350~400 nm。(d) pH对Mn-CDs荧光强度的影响

3.3. TC对Mn-CDs的荧光内滤效应

在pH6的条件下，TC在360 nm处具有明显的吸收峰，与Mn-CDs的荧光发射峰具有较大的重叠(图3(a))，这表明Mn-CDs和TC之间可能发生共振能量转移(FRET)或者内滤作用(IFE)。在一定量的Mn-CDs溶液中，分别加入不同浓度的TC标准溶液(1~200 µM)，依次扫描体系的荧光光谱，结果如图3(b)所示。从图可以看出，随着TC浓度的增加，Mn-CDs的荧光发射峰逐渐降低。加入和不加入TC时Mn-CDs的荧光强度分别为I和I₀，则lg(I₀/I)与TC浓度(C, μM)之间具有良好的线性关系。线性方程为(log(I₀/I) = 0.01 535C + 0.01 236)。基于此建立的TC分析方法的检出限为0.08 µM，相对标准偏差为2.1% (c = 100 μM)。

图3. (a) 盐酸四环素的紫外–可见吸收光谱(曲线1)和Mn-CDs的荧光发射光谱(曲线2)；(b) 体系中存在不同浓度的TC时，Mn-CDs的荧光响应曲线(1~200 µM)

为了进一步确定Mn-CDs与TC之间的作用机理，测定Mn-CDs在荧光猝灭前后的荧光寿命变化是鉴别荧光猝灭机理最直接的手段，测定结果表明，Mn-CDs的荧光寿命为6.24 ns；加入TC后Mn-CDs的荧光寿命为6.25 ns，这表明，Mn-CDs在加入TC前后，其荧光寿命并未发生明显变化。因此，可以排除Mn-CDs与TC之间的FRET作用。

为了证明Mn-CDs与TC之间的内滤作用(IFE)，参考文献 [24] [25] 提出的数学模型对Mn-CDs的荧光进行了光谱校正，校正方法可以用如下式子表示：

$\frac{I_{corr}}{I_{obse}}={10}^{\left(A_{ex}x+A_{em}y\right)}$

等式中，x和y分别代表测量过程中激发光束和发射光束的光程，Aex和Aem分别表示在所对应的激发波长和发射波长处所对应的紫外吸光度。Mn-CDs与TC直接混合后，迅速进行UV-vis吸收光谱的测定，实验条件如与图3(b)一致。如图4，CDs和FITC混合后的UV-vis吸收光谱，通过上式对Mn-CDs的荧光强度进行校正，结果显示校正之后Mn-CDs的实际荧光强度在加入不同量TC后强度基本保持不变，因此可以确定Mn-CDs荧光的猝灭是由于加入TC后Mn-CDs和TC之间IFE作用引起。

3.4. Mn-CDs荧光探针的选择性

在优化的实验条件下，考察了常见的共存物质对荧光探针的影响。图5(a)给出一系列有机共存物(100 μM)分别与TC (10 μM)共存于Mn-CDs体系中时，共存体系与Mn-CDs-TC体系的荧光强度没有明显差别，这表明共存物对Mn-CDs-TC体系没有明显的影响。图5(b)则考察了不同金属离子(100 μM)分别与TC (10 μM)共存于Mn-CDs体系中时，除了Fe³⁺离子外，其他金属离子共存体系与Mn-CDs-TC体系的荧光强度没有明显差别；而当Fe³⁺离子降低至10 μM时，共存体系与Mn-CDs-TC体系的荧光强度具有良好的一致性。因此，Mn-CDs作为TC的荧光探针具有良好的选择性。

图4. Mn-CDs，TC和Mn-CDs-TC混合体系的紫外–可见吸收光谱；Mn-CDs和TC的吸收光谱的加和曲线

图5. 干扰实验(a) 氨基酸；(b) 金属离子。(BR缓冲液，pH 6.0，TC，氨基酸和金属离子的浓度：100 µM，其中带有*浓度为10 µM)

4. 实际样品分析

将本方法应用于鸡肉、鲫鱼肉和鸭肉样品中TC的测定。采用标准曲线法对提取液中TC含量进行了测定，并做了加入回收实验，回收率在102.1%~115.1%之间(见表1)。

5. 结论

以PAN和MnCl₂为原料，一步水热法制备了Mn掺杂CDs。以所制备Mn-CDs为荧光探针，构建了基于内滤效应(IFE)的TC荧光分析新方法。该方法的检出限为0.012 μM，线性范围为1~200 μM。该方法成功应用于动物源食品中TC的残留分析。

表1. 动物肉样品中TC含量的测定(n = 3, mean ± SD, μg/g)

基金项目

河南工业大学科教融合项目。

文章引用

郑彬,张兰兰,胡冰倩,雷雯,严民民,柳金枝,李清媛,黄飞宏,孙巍巍,向国强. 基于内滤效应的碳量子点荧光探针测定食品中盐酸四环素
Determination of Tetracycline Hydrochloride in Food Samples by Carbon Dots Based on Fluorescence Inner Filter Effects[J]. 自然科学, 2019, 07(02): 72-79. https://doi.org/10.12677/OJNS.2019.72012

参考文献