Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 51-57 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2012.22009 Published Online June 2012 (http://www.hanspub.org/journal/bp) Overproduction of Lycopene by Metabolic Engineering Escherichia coli Zhiming Weng, Yue Wang, Jianzhong Liu* Biotechnology Research Center, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou Email: *lssljz@mail.sysu.edu.cn Received: May 4th, 2012; revised: May 21st, 2012; accepted: May 29th, 2012 Abstract: Lycopene is an effective antioxidant and a potential pharmaceutical drug with anticancer. The knockout of gdhA, aceE or fdhF was beneficial to lycopene production in engineered E. coli. The double (gdhA and aceE) gene knockouts showed a similar effect to the triple (gdhA, aceE and fdhF) on lycopene production. Replacement of native promoter of dxs gene in the double gene knockout strain resulted in 103% increase in lycopene content. In order to avoid application of expensive inducer, we also constructed some constitutive plasmids containing heterologous caro- tenoid genes. The final engineered E. coli BW25113 (ΔgdhAΔaceE, PT5-dxs, pAC316-WZM4R) produced lycopene of 15.6 mg/g DCW without inducer in a batch shake flask. Keywords: Lycopene; Escherichia coli; Metabolic Engineering; Promoter Replacement; Constitutive Plasmid 代谢工程大肠杆菌过量生产番茄红素 翁志明,王 玥,刘建忠* 中山大学生命科学学院生物工程研究中心,广州 Email: *lssljz@mail.sysu.edu.cn 收稿日期:2012 年5月4日;修回日期:2012年5月21 日;录用日期:2012 年5月29日 摘 要:番茄红素是一种高效抗氧化剂和潜在抗癌药物。gdhA、aceE 和fdhF 基因敲除促进了重组大肠杆菌番 茄红素的合成,其中 gdhA 和aceE双基因敲除和 gdhA、aceE 和fdhF三基因敲除具有相似的作用。在 gdhA和 aceE 双基因敲除的基础上,dxs 基因天然启动子被 T5 启动子置换后,重组大肠杆菌番茄红素的产量提高了103%。 为了避免采用诱导剂进行基因表达,构建了一系列组成型质粒,最终构建的代谢工程大肠杆菌 BW25113(ΔgdhAΔaceE、PT5-dxs、pAC31 6-W ZM 4R) 在不需诱导条件下摇床发酵可产番茄红素15.6 mg/g DCW。 关键词:番茄红素;大肠杆菌;代谢工程;启动子置换;组成型质粒 1. 引言 番茄红素(Lycopene)是类胡萝卜素的 一种,是 一 种很强的抗氧化剂,具有极强的清除自由基的能力, 是淬灭单线态氧和清除过氧化氢等自由基能力最强 的类胡萝卜素,其猝灭活性是 -胡萝卜素的 2倍、维 生素 E的100 倍。对防治前列腺癌、肺癌、乳腺癌、 子宫癌等有显著效果,还有预防心脑血管疾病、提高 免疫力、延缓衰老等功效,有植物黄金之称,被誉为 “21 世纪保健品的新宠”。为此,番茄红素的生产引 起了各国学者注意。国内研究主要集中在利用三孢布 拉氏霉菌(Blakeslea trispom)发酵生产番茄红素。但因 三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispom)发酵是一个嗜氧高 黏的发酵,生产成本高,而难以与番茄提取法竞争。 *通讯作者。 近年来,随着代谢工程技术的发展,国际上许多 Copyright © 2012 Hanspub 51 代谢工程大肠杆菌过量生产番茄红素 学者通过代谢工程技术将外源番茄红素合成基因簇 导入大肠杆菌实现了大肠杆菌生产番茄红素,并取得 了可喜的进展[1-11] 。这样便可利用大肠杆菌高密度发 酵技术高效生产番茄红素,而且因大肠杆菌本身并不 能合成番茄红素,当外源番茄红素合成基因簇转入大 肠杆菌后,并不会合成其它类胡萝卜素,从而简化了 下游提取步骤。但是国际上大都采用诱导性表达载体 来表达番茄红素合成基因[1-9],发酵过程需要添加诱导 剂,从而会增加生产成本。国内学者在这方面的研究 与先进国家的差距,我们在国际学者的研究基础上, 采用基因敲除、启动子置换和组成型表达载体的构建 等策略,构建了一株不需诱导的代谢工程大肠杆菌以 生产番茄红素,其番茄红素的发酵水平达到了国际先 进水平。 2. 材料和方法 2.1. 菌株和质粒 表1是本研究所使用的菌株和质粒。大肠杆菌 DH5 用于质粒构建,大肠杆菌BW25113 为宿主菌。 pAC-LYC04 和pAC-LYC 由马里兰大学的 Cunningham 教授惠赠[12]。 -Red重组质粒 pKD46、 pKD3、pKD4 和pCP20 用于基因敲除和启动子置换, 由普渡大学 Wanner 教授惠赠[13]。pBAD24 由哈佛医 学院 Beckwith 教授惠赠[14]。 2.2. 基因敲除和质粒构建 基因敲除和 dxs 基因的天然启动子置换采用 pKD46 表达的 -Red 重组系统[13]。本研究所用引物见 表2。 利用相应引物从pAC-LYC04 中,分别 PCR 扩增 得到 crtE、crtI、crtB 和ipi 基因片段,连接到质粒 pBAD24中,分别得到质粒pBAD-crtE、pBAD-crtI、 pBAD-crtB和pBAD-ipi。Kpn I和XbaI酶切 pBAD-crtI、 XbaI和SalI酶切 pBAD-crtB 基因片段连接到 KpnI和 SalI酶切pBAD-crtE 载体片段中,获得质粒 pBAD-crtEIB。SalI和HindIII 酶切 pBAD-ipi基因片 段,连接到相同内切酶处理后的 pBAD-crtEIB,获得 pBAD-crtEIBipi,简称 pB-WZM1。EcoRI 切pB-WZM1 质粒后得到的载体片段(8821 bp),进行 CIAP 去磷酸 化处理后分别同 EcoRI 酶切 pB-rpoS 质粒后的rpoS 片段、EcoRI 酶切 pB-DR 后的 dxs-rpoS 片段和 EcoRI 酶切 pB-dxs 后的dxs 片段连接,得到的质粒经 PCR 和酶切验证插入方向正确的,分别命名为 pBAD- rpoS-crtEIBipi(简称 pB-WZM2) 、pBAD-dxs-rpoS- crtEIBipi(简称 pB-WZM3)和pBAD-dxs-crtEIBipi (简 称pB-WZM4)。 BamHI切pAC-LYC 后得到载体片段(4893 bp), 用Pfu DNA聚合酶进行补平反应后直接连接,得到 pACYC315。BamHI-SalI切pAC-LYC 后得到载体 Table 1. Strains and plasmids used in the stude 表1. 菌种和质粒 Strain and plasmid Description Source or reference Strains E. coli DH5 supE44 Δ(lacZYA-argF) U169 (Φ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA endA1 gyrA96 thi-1 relA1 Laboratory store E. coli BW25113 lacIq rrnBT14 ΔlacZWJ16 hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78 Laboratory store Plasmid pAC-LYC04 pACYC184 with Erwinia herbicola crtE 、 crtI and crtB genes, and Haematococcus pluvialis ipi gene 12 pAC-LYC pACYC184 with Erwinia herbicola crtE 、 crtI and crtB genes 12 pKD3 oriR6K, FRT::cat::FRT template plasmid Cmr, Ampr 13 pKD46 oriR101 repA101ts P-araB-gam-bet-exo Ampr 13 pCP20 pSC101 repliconts Flp(λRp) cI857 Cmr, Ampr 13 pBAD24 ColE1 ori, PBAD L-arabinose inducible Ampr 14 pQE30 ColE1 ori, PT5 IPTG inducible Ampr Laboratory store pB-rpoS pBAD24 with E. coli rpo gene flanked by two EcoRI sites Laboratory store pB-dxs pBAD24 with E. coli dxs gene flanked by two EcoRI sites Laboratory store pB-DR pBAD24 with E. coli dxs and rpoS genes flanked by two EcoRI sites Laboratory store Copyright © 2012 Hanspub 52 代谢工程大肠杆菌过量生产番茄红素 Table 2. Primersa 表2. 引物 a Name Purpose 5’→3’sequence Restriction enzyme gdhA1 AACCAT GTCCAAAAGCGCGA CCCGAATCAAACCGAGTTCGTGAG - CGATTGTGTAGGCTGGAG gdhA2 gdhA knockout TCACACCCTGCGCCAGCATCGCATCGGCAACCTTCACAAACT- TAACGGCTGACATGGGAATTAG fdhF1 GAAAAAAGTCGTCACGGTT TGCCCCTATTGCGCAT- CAGGTTGCAAAATCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC fdhF2 fdhF knockout TACGCC AGTGCCGCTTCGCG CAGGCGAGTTTTC AACTTGTTGTACT CGTCATTCCGGGGATCCGTCGACC aceE1 aceE knockout ATGTCAGAACGTTTCCCAAATGACGTGGATCC GATC- GAAACTCGCGACTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC aceE2 TTACGC CAGACGCGGGTTAACTTTATCTGCATC- GATGT TGAATTTGGCGAATTCCGGGGATCCGTCGACC P1 TAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCC P2 ggagtcgacc agtgccaggg tcgggtattt ggcaatatca aaacTCATAG TTAATTTCTC CTCTTTAATG P3 tg gaagcgctag cggactacat catccagcgt aataaataac GTCTTGAGCG ATTGTGTAG P4 GGTGGATCCT ATGAATATCC TCCTTAGTTC C BamHⅠ P5 Replacement of the native promoter of dxs gene by T5 promoter of pQE30 CTGAATTCCG TCTTGAGCGA TTGTGTAGGC Eco RⅠ crtE-f CCGGAATTCAGGAGGTAATAAATATGGTGAGTGGCAGTAAAGC EcoRⅠ crtE-r PCR for crtE GAAGGTAC CTTATCAGGCGATTTTCATGACC Kpn I crtI-f TGTGGTACCAGGAGGTATAAAGGATGAAAAAAACCGTTG Kpn I crtI-r PCR for crtI GCTTCTAGATCATCAGGCTGGCGGTGGCTTTC XbaI crtB-f CGCGGTA CCTCTAGAGGAGGATCTGCAATGAGCCAACC KpnI、XbaI crtB-r PCR for crtB TGGTCGACTTACTAAACGGGACGCTGCCAAAG SalI ipi-f GCGTCGACAGGAGGTAATAAAATATGCTTCGTTCGTTGCTCAG SalI ipi-r PCR for ipi GCGAAGCTTAGCTAGCTTATCACGCTTCGTTGATGTGAT HindIII、NheI aHomology arms to recombination target genes are in bold; restriction enzyme sites are underlined. 片段(4249 bp),用 Pfu DNA 聚合酶进行补平反应后直 接连接,得到 pACYC316。EcoRV 分别切 pACYC315 和pACYC316,得到的 4472 bp和3832 bp载体片段 分别进行 CIAP 去磷酸化处理,胶回收产物分别与补 平后的NheI酶切自 pB-WZM1-4 的4种目的片段 WZM1、WZM2、WZM3 和WZM4 进行连接,理论 上可以得到正反连接的8种pAC315 系列质粒和8种 pAC316 系列组成型质粒,分别命名为pAC315- WZM1-4F/R 和pAC316-WZM1-4F/R(F 指WZM1-4 正 向连接,R指WZM1-4 反向连接)。实际得到了 13 种 组成型质粒。 2.3. 培养条件 种子培养基为2YT-KAc,发酵培养基为2YT-KAc 和2 × M9-glucose。除了2YT-KAc 含0.5% KAc外, 其余的发酵培养基在最后发酵的时候均含 2 mM KAc。培养基中添加相应抗生素。种子液于37℃,150 rpm 中摇过夜后,按1%接种量接种到 50 mL发酵培 养基中,发酵培养基于30℃,150 rpm中发酵两天后 提取番茄红素并定量。 2.4. 分析 发酵液发酵两天后,取少量菌液离心收集菌体, 并用蒸馏水洗涤2~3 次,沉淀菌体重悬于1 mL丙酮 中,抽提液于 55℃水浴中保温 15 min后,于室温下 10,000 rpm 离心 5 min,取上清液于暗处保存。再用丙 酮抽提 2次,合并抽提液,通过测定抽提液在 472 nm 下的吸光度,来计算番茄红素含量。另外,取 15 mL 以上的发酵液装于 50 mL离心管中,于 8000 rpm中 离心 10 min后去上清,沉淀于 105℃中烘6 h以上, Copyright © 2012 Hanspub 53 代谢工程大肠杆菌过量生产番茄红素 然后称量菌体干重,根据测出的番茄红素的产量就可 算出单位干菌重的番茄红素产量。同时测量发酵液的 OD600。 3. 结果与讨论 3.1. 基因敲除 根据 Stephanopoulos 研究小组代谢通量平衡分析 (FBA)显示敲除大肠杆菌的 fdhF 、 aceE 和gdhA 基因, 将促进大肠杆菌番茄红素的合成[2]。为此,我们利用 -Red 重组技术,敲除了大肠杆菌 BW25113 的fdhF 、 aceE 和gdhA 基因,并将含番茄红素合成基因簇crtEIB 和ipi 的质粒 pAC-LYC04 导入敲除菌中,检测基因敲 除对番茄红素合成的影响,结果见图1(a)。从图 1(a) 可看出,营养丰富的 2YT培养基比 2M9培养基更适 合于番茄红素的合成。为此,以后实验我们采用 2YT 培养基进行番茄红素的发酵生产。单基因敲除无论在 2M9 还是在 2YT 培养基中,对番茄红素合成稍有促 进作用,但是多基因敲除对番茄红素合成有较强的促 进作用。在2M9 培养基中,三基因敲除对番茄红素合 成的促进作用最强,这与Stephanopoulos 研究小组报 道结果一致[2],但是在 2YT 培养基中,aceE和gdhA 双基因敲除和fdhF 、 aceE 和gdhA 三基因敲除的促进 作用差不多。因此,后面研究中我们以aceE 和gdhA 双基因敲除菌作为宿主菌。gdhA 编码谷氨酸脱氢酶, 催化 α-酮戊二酸和 NADPH 转化成谷氨酸,敲除 gdhA 能够增加NADPH 的供应,而合成1 mol番茄红素需 要16 mol NADPH[2]。fdhF 编码甲醛脱氢酶,催化甲 醛转化为CO2,敲除 fdhF 后可以减少丙酮酸(Pyr)流向 甲醛及其副产物,从而提高丙酮酸的供给。aceE 编码 丙酮酸脱氢复合体的 E1亚基(丙酮酸脱氢酶组分),敲 除aceE 阻止了丙酮酸向乙酰辅酶 A的转化,同样可 以增加丙酮酸的供给。从图1(b)可看出,基因敲除将 抑制菌体的生长,尤其aceE 基因的敲除将严重抑制 菌体的生长,但当添加KAc 后又将削弱因aceE 敲除 而引起的生长抑制。这主要是由于aceE基因的敲除 造成了乙酰辅酶 A供给的不足,从而抑制了柠檬酸循 环,导致一些氨基酸和ATP 的合成受到抑制,因此严 重影响了菌体的生长。KAc 通过 acs编码的乙酰辅酶 A合成酶催化生成乙酰辅酶A,添加KAc 可弥补因 aceE 被敲除而导致的乙酰辅酶 A供应的不足[15]。实 验还发现,添加 2 mM KAc能够部分消除敲除 aceE 对菌体生长造成的影响,而添加0.5% KAc则基本能 够完全消除敲除 aceE 对菌体生长造成的影响(结果未 呈现)。 3.2. dxs 基因启动子置换 dxs 基因编码1-脱氧-D-木酮糖-5 -磷酸(DXP)合成 酶,催化甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(Pyr)合成 DXP, 它是大肠杆菌通过 MEP 途径合成 IPP(合成番茄红素 重要前体)的第一个步骤。许多研究发现 dxs 基因是番 茄红素合成的关键基因,dxs 基因的过量表达将促进 番茄红素的合成[3-6]。可是基于质粒的基因过量表达, 然能提高基因的表达水平,但同时又将增加代谢 虽 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 2 YT + KAc BW25113 BW25113(gdhA) BW25113 (gdhA, AceE) BW25113 (gdhA, fdhF) BW25113 (gdhA, fdhF, aceE) Lycopene content (mg/g DCW) A 2M9 + glucose (a) 0 2 4 6 8 10 12 +2 mM KAc BW25113( gdhA, fdhF, aceE) BW25113( gdhA, fdhF, aceE) BW25113( gdhA, aceE) BW25113( gdhA, aceE) BW25113( gdhA, fdhF) BW25113( gdhA) Cell growth (OD600) BW25113 +2 mM KAc B (b) Figure 1. Effects of gene knockout on lycopene production (a) and cell growth (b) in E. coli BW25113 harboring pAC-LYC04 图1. 基因敲除对番茄红素合成(a)及重组大肠杆菌生长(b)的影响 Copyright © 2012 Hanspub 54 代谢工程大肠杆菌过量生产番茄红素 负担、消耗代谢中间产物,而且存在质粒不稳定性(包 括结构不稳定性和分离不稳定性)的缺陷[16,17]。增大启 动子强度同样是提高基因表达水平的一种方法。近年 来,启动子工程已成功应用于代谢工程领域,以调节 基因的表达从而提高产物的合成产率[8,9]。为此,我们 利用 -Red重组技术,将大肠杆菌 BW25113(ΔgdhA ΔaceE)的dxs 基因的天然启动子置换成 pQE30 的T5 启动子。结果表明,T5 置换导致重组大肠杆菌番茄红 素产量提高了103%(表3)。Yu an等在研究 -胡罗卜素 时获得了相似的结果,他们研究发现dxs 基因的天然 启动子置换成 T5启动子导致重组大肠杆菌 -胡罗卜 素产量提高了 1倍[8]。Alper 等利用易错 PCR技术将 PLtetO-1 启动子进行随机突变,构建了一个具有不同强 度的启动子文库,并将获得的强启动子置换大肠杆菌 dxs 基因的天然启动子,发现增大启动子强度将有利 于重组大肠杆菌番茄红素的合成[9]。 3.3. 组成型质粒的构建 组成型质粒因不需要添加诱导剂,这有利于工业 化生产。pAC-LYC04 也是一个组成型质粒,它含有草 生欧文氏菌(Erwinia herbicola) crtEIB 和雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis) ipi 基因,但在 crtE 和crtI 中间存在一段未知基因。Kang 等研究发现去除这段未 知基因将导致大肠杆菌番茄红素产量提高了 3倍[5]。 为此,我们从pAC-LYC04 中扩增 crtE 、 crtI 、 crtB 和 ipi 基因,并将其串联在一起,同时与其它关键基因相 连接,成功构建获得了 13 种pAC315(4893 bp)和 pAC316(4253 bp)系列的组成型表达载体。图 2为代表 性的含不同组成型质粒大肠杆菌BW25113 产番茄红 素的情况。从图2可看出,无论是含pAC315 还是含 pAC316 质粒的重组大肠杆菌合成番茄红素的水平都 比对照菌(含pAC-LYC04)高;而且在反向连接表达相 同基因时(如WZM1R、WZM3R 或WZM4R),采用 pAC316 系列质粒的番茄红素产量远远高于采用 pAC315 系列质粒的产量。这主要是由于目的基因距 离启动子越远,转录水平相应下降,从而导致代谢终 产物产量下降[18]。在正向连接时,基因表达是利用载 体的四环素抗性基因的启动子,而反向链接时则利用 载体的氯霉素抗性基因启动子。在反向链接时,采用 pAC315 系列质粒中氯霉素抗性基因启动子与目的基 Table 3. Effect of the replacement of native promoter of dxs gene by the promoter of T5 on lycopene production 表3. dxs 基因启动子置换的影响 Strain Lycopene content (mg/g DCW) BW25113 (ΔgdhAΔaceE, pAC-LYC04) 3.15 ± 0.19 BW25113 (ΔgdhAΔaceE, pAC-LYC04, PT5-dxs) 6.40 ± 1.58 0 1 2 3 4 5 6 7 8 WZM 4R WZ M 4F WZM 3R WZM 1R Lycopene content (mg/g DCW) Control Figure 2. Effects of constitutive plasmids on lycopene production by E. coli BW25113. pAC315(open bars); pAC316 (solid bars). R represents reverse ligation; F represents forward ligation. E. coli BW25113 (pAC-LYC04) was controlled strain 图2. 组成型质粒对野生型大肠杆菌合成番茄红素的影响。 pAC315(空白柱);pAC316(黑体柱)。R指反相连接;F指反相连 接。大肠杆菌 BW25113 (pAC-LYC04)为对照菌 因间距离比 pAC316 系列质粒的长约640 bp。 将上述筛选得到的番茄红素产量较高的 3个质粒 pAC315-WZM4F 、pAC316-WZM3R 和pAC316- WZM4R 分别转化到上面的基因敲除菌 BW25113 (ΔgdhAΔaceE),考察其番茄红素的合成。结果见图3。 结果表明含组成型质粒 pAC315-W ZM4F、pAC316- WZM3R 和pAC316-WZM4R 的菌株番茄红素产量都 远远高于含 pAC-LYC04 对照菌,其中含 pAC316- WZM3R 和pAC316-WZM4R 菌产量最高。接着,将 它们转化到双基因敲除的 dxs 启动子T5 置换菌 BW25113 (ΔgdhAΔaceE,PT5-dxs)中,考察其番茄红素 的合成。结果见图 3。结果表明,含 pAC316-W ZM3R 和pAC316-WZM4R 的dxs 启动子T5置换的双基因敲 除菌,番茄红素产量得到了进一步提高,其中大肠杆 菌BW25113 (ΔgdhAΔaceE,PT5-dxs,pAC316-WZM4R) 可产 15.47 mg/g DCW)。从图 3同样可看出,各种质 粒对细胞生长影响不大。 Copyright © 2012 Hanspub 55 代谢工程大肠杆菌过量生产番茄红素 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 E. coli BW25113 (gdhA aceE) pAC316-WZM4R pAC316-WZM3R pAC316-WZM4R pAC316-WZM3R pAC315-WZM4F Cell growth (g/L) Lycopene content (mg/gDCW) pAC-LYC04 E. coli BW25113 (gdhA aceE, PT5-dxs) Figure 3. Effects of constitutive plasmids on cell growth (open bars) and lycopene production (solid bars) by engineered E coli 图3. 组成型质粒对工程大肠杆菌生长(空白柱)和合成番茄红素(黑 体柱)的影响 3.4. 发酵过程的表征 为了了解最后构建的工程菌培养过程特性,我们 测定了大肠杆菌 BW25113 (ΔgdhAΔaceE,PT5-dxs, pAC316-WZM4R)不同发酵时间的菌体生长和番茄红 素合成,如图 4。由图可知,重组大肠杆菌经过短暂 的适应期后,很快进入对数生长期,大约 26 h 细胞生 长达到最大值,其后由于营养成分的不足,细胞进入 衰老期,细胞浓度开始下降。番茄红素同样在对数生 0 20406080100 0 2 4 6 8 10 Cell growth (OD600) Time (h) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Lycopene content (mg/g DCW), Lycopene concentration (mg/L) Figure 4. Time course of recombinant E . c o l i BW25113(ΔgdhAΔaceE, PT5-dxs, pAC316-WZM4R) growth and lycopene production. Cell growth (■), lycopene content (●) and lycopene concentration (○). Data represent the mean of the tripli- cate cultures ± standard deviation 图4. 重组大肠杆菌BW25113 (ΔgdhAΔaceE,PT5-dxs, pAC316-WZM4R)发酵过程时间曲线。生长(■),番茄红素含量(●) 和番茄红素浓度(○),数据为三批发酵的平均值 ± SD 长期开始大量合成,34 h左右番茄红素产量达到最大 值(40.1 mg/L),其后番茄红素产量几乎不变,但菌体 中番茄红素含量却仍慢速地增加,到 48 h 菌体中番茄 红素含量达到最大值 15.6 mg/g DCW,该值接近目前 研究重组大肠杆菌产番茄红素最系统的美国麻省理 工大学 Stephanopoulos 教授课题组的先进水平[1-3]。由 此可说明,重组大肠杆菌番茄红素的合成是生长耦联 的,在发酵后期若能进行营养物质的补充(如采用后期 流加补料工艺),番茄红素产量可望进一步提高。 4. 结论 aceE 和gdhA 基因敲除,同时关键基因 dxs天然 启动子被强启动子T5置换,大大提高了大肠杆菌合 成番茄红素的能力。所构建的大肠杆菌 BW25113 (ΔgdhAΔaceE,PT5-dxs)在引入异源胡萝卜素基因后,同 样可作为合成其它类胡萝卜素(如 -胡罗卜素、玉米黄 素、角黄素、虾青素、海胆酮等)的出发菌株。我们构 建的代谢工程大肠杆菌W25113 (ΔgdhAΔaceE,PT5-dxs, pAC316-WZM4R)在发酵培养 48 h时,可产番茄红素 15.6 mg/g DCW,而且我们构建的工程菌由于采用组 成型质粒,不需要诱导剂,从控制生产成本的角度来 看,这对放大培养是有利的。为了进一步提高番茄红 素的产率,今后的工作一方面可考虑将关键基因整合 到染色体上,同时结合其它关键基因启动子的置换, 以减轻高拷贝质粒引起的代谢负担,增加工程菌的遗 传稳定性;另一方面可尝 试对已 构建 的工程 菌 W25113 (ΔgdhAΔaceE,PT5-dxs,pAC316-WZM4R) 进行 发酵培养条件的优化及高密度发酵,以提高番茄红素 的产量,为工业化生产奠定基础。 5. 致谢 本项目得到了国际自然科学基金项目(No. 3097 0089)和广东省自然科学基金项目(No. 9351027501 000003,S2011010001396)的资助,在此表示感谢! 参考文献 (References) [1] H. 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