¹黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨

²黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨

收稿日期：2022年7月11日；录用日期：2022年8月8日；发布日期：2022年8月15日

摘要

目的：运用肝肾同源理论及网络药理学研究肉苁蓉–巴戟天干预迟发性性腺功能减退症可能存在的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)对肉苁蓉–巴戟天药对中活性成分靶点进行筛选，通过GeneCards、OMIM数据库检索迟发性性腺功能减退症靶点，取得交集基因后使用Cytoscape3.9.0建立化合物–疾病–靶点调控网络，基于生物学信息注释数据库(DAVID)对核心靶点数据信息进行下载，并用R软件绘制气泡图取得(GO)功能富集分析与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果：得到肉苁蓉–巴戟天药对的22个活性成分和271个潜在靶点，相关的疾病靶点2462个。GO富集分析主要包括正向调节凋亡过程、细胞因子介导的信号通路、药物反应、线粒体、蛋白质结合、酶结合等功能途径。KEGG通路分析主要包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、缺氧诱导因子1 (HIF-1)信号通路、糖尿病并发症中的RAGE信号通路等。结论：基于网络药理学及肝肾同源理论初步揭示出肉苁蓉–巴戟天药对干预LOH具有活性成分及作用靶点多样、作用途径广泛的特点，其作用机制可能与有效成分槲皮素、β谷甾醇，核心靶点及相关通路对睾丸间质细胞及支持细胞的调节，影响睾酮分泌有关。

关键词

网络药理学，肝肾同源，迟发性性腺功能减退症，肉苁蓉，巴戟天

Study on the Mechanism of Cistanches Herba and Morindae Officinalis Radix Intervening Late-Onset Hypogonadism Based on Network Pharmacology and the Theory of “Homogeny of Liver and Kidney”

Huijie Ren¹, Liwen An^1,2, Yuyan Guo¹, Hongtao Li², Xinxin Chen², Shan Gao^1,2*

¹Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang

²The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang

Received: Jul. 11^th, 2022; accepted: Aug. 8^th, 2022; published: Aug. 15^th, 2022

ABSTRACT

Objective: Study the possible mechanism of Cistanches Herba and Morindae Officinalis Radix intervening late-onset hypogonadism (LOH) by using the theory of “homogeny of liver and kidney” and network pharmacology. Methods: The active component targets of Cistanches Herba and Morindae Officinalis Radix were screened through Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). The targets of late-onset hypogonadism were searched through Gene Cards and OMIM databases. After obtaining the intersection genes, the compound-disease-target regulation network was established by using Cytoscape 3.9.0, and the core target data information was downloaded based on the database for annotation, visualization and integrated discovery (DAVID). The bubble diagram was drawn with R software to obtain (GO) functional enrichment analysis and genomic encyclopedia (KEGG) pathway enrichment analysis. Results: 22 active components and 271 potential targets of Cistanches Herba-Morindae Officinalis Radixwere were obtained, and 2462 related disease targets were obtained. GO enrichment analysis mainly includes functional pathways such as positive regulation of protein phosphorylation, cytokine-mediated signaling pathway, angiogenesis, mitochondrion, zincion binding, transcription factor binding and so on. KEGG pathway analysis mainly includes MAPK signaling pathway, TNF signaling pathway, HIF-1 signaling pathway, and RAGE signaling pathway in diabetic complications. Conclusion: Based on the network pharmacology and the theory of “homogeny of liver and kidney”, it is preliminarily revealed that Cistanches Herba and Morindae Officinalis Radix have the characteristics of diverse active components, action targets and wide action pathways in the intervention of LOH, and its action mechanism may be related to the effective components quercetin, β Sitosterol, core targets and related pathways regulating Leydig cells and Sertoli cells, affecting testosterone secretion.

Keywords:Network Pharmacology, Homogeny of Liver and Kidney, Late-Onset Hypogonadism, Cistanches Herba, Morindae Officinalis Radix

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

迟发性性腺功能减退症(late-onset hypogonadism, LOH)是雄性激素缺乏导致的一系列临床综合征 [1] [2]，LOH是指老年健康男性相对于健康年轻男性而言，血睾酮随年龄增长逐渐低于正常参考值 [3]，且伴随易疲劳乏力、心血管舒缩、精神心理及性功能障碍等睾酮不足的临床表现，并逐渐导致生活质量下降和多器官的损害 [4]。LOH和血清睾酮水平低下患者在我国40岁以上占9.1%，而在欧洲占2%~15% [5] [6]。LOH发病机制并不确切，核心机制是睾酮水平低下 [7]，而非唯一原因；我们要不断发掘并完善LOH相关机制，争取在临床取得满意的效果。

肝藏血，肾藏精，精聚为髓，髓化生为血，精血同源与肝肾，故肝肾同源；中医学肝肾同源和现代医学研究肝肾疾病与“神经–内分泌–免疫系统”及生殖轴基本相似 [8]。

据报道中药补阳药有类雄性激素样作用，“肉苁蓉–巴戟天”相须为用能提高补阳药疗效 [9]，临床用于补肾阳、益精血、起阳痿、暖腰膝等。肉苁蓉归肾、大肠经，临床用于补肾阳、益精血、起阳痿等。巴戟天归肾、肝经，临床用于肾阳、筋骨痿软等证 [10]。单一的一药一靶点一疾病的研发模式被网络药理学所改变，开启了多靶点、多种疾病间复杂网状关系的新研究模式，与中医的整体观念相吻合 [11]。本研究基于网络药理学探讨肉苁蓉–巴戟天药对干预LOH的作用机制，意在从分子学角度揭示肉苁蓉–巴戟天干预LOH的作用机制，为中医药干预LOH提供研究方向以及科学依据。

2. 材料与方法

2.1.1. “肉苁蓉-巴戟天”活性成分及作用靶点筛选与预测

通过TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php.2.3)分别以“肉苁蓉巴戟天”为关键词检索其化学成分，类药性(DL)是测定药物研发过程中，化合物是否符合成药标准的依据，口服药物主要通过小肠上皮细胞吸收，而小肠上皮细胞的通透性在口服生物利用度(OB)中至关重要，从文献 [12] 阅读相关文献以口服生物利用度(OB) ≥ 30%，类药性(DL) ≥ 0.18，渗透性(Caco-2) ≥ −0.4 [13] 作为筛选活性成分的标准条件，并去除有效成分中无明确作用的靶点。从TCMSP数据库中检索收集候选的活性成分所对应靶点，与利用UniProt (https://www.uniprot.org/)数据库所筛选靶蛋白名称进行基因配对。

2.1.2. 迟发性性腺功能减退潜在靶点的筛选

以“Late-onse thypogonadism”为关键词，分别在GeneCards (https://www.genecards.org/, 4.12)、OMIM (https://omim.org/)数据库中检索迟发性性腺功能减退症潜在靶点并下载相关数据信息，两组基因取交集并去除重复值。

2.1.3. 核心靶点筛选及PPI网络构建

将“肉苁蓉–巴戟天”药对与迟发性性腺功能减退症的交集靶点，导入STRING (https://string-db.org/cgi/input.pl, 11.2)选择“multiple proteins”，种属设定为“homosapiens”，进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)分析，结合文献，试验将置信度评分设置为 > 0.9“high confidence”(0.900)“hided is connected nodes in the network”并剔除蛋白相互作网络图(PPI网络)中无关联节点其余参数默认，构建交集靶点相互作用网络拓扑。建立调控网络以便于“肉苁蓉–巴戟天”对迟发性性腺功能减退症的作用机制可视化呈现。

2.1.4. GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

将肉苁蓉–巴戟天干预迟发性性腺功能减退症交集靶点导入DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp, 6.8)，选择智人“Homosapiens”和函数注释图表“Functional Annotation Chart”数据库下载相关信息，通过UltraEdit导入题录更改储存位置，导入R (R version 4.1.0)语言运行即可得到气泡图。

3. 结果

3.1. “肉苁蓉–巴戟天”活性成分及作用靶点筛选与预测

获取各活性成分的对应靶点并在中药相关靶点不足时，利用BATMAN数据库、TCMIP数据库对药物成分及靶点进行补充。对所获得的化学成分、靶点、和对应的中药名进行统计，结果见表1。在TCMSP检索得出肉苁蓉-巴戟天活性成分24个，排除未获得对应靶点的2个有效成分，最终获得活性成分22个；有效成分所对应的靶点271个，其中肉苁蓉175个，巴戟天96个。

表1. 肉苁蓉–巴戟天活性成分基本信息

3.2. 迟发性性腺减退症疾病靶点筛选

在OMIM、GeneCards数据库中获得相关疾病靶点分别为647、1817个；剔除重复基因后获得与迟发性性腺功能减退症相关的2462个靶点。利用Venny2.1.0在线平台将肉苁蓉、巴戟天有效靶点与迟发性性腺功能减退症相关的疾病靶点进行映射建立Venn图，筛选交集靶点“肉苁蓉–巴戟天”迟发性性腺功能减退症的潜在靶点。获取交集靶点将肉苁蓉-巴戟天的271个作用靶点与LOH的2462个作用靶点进行匹配取交集，经Uniprot校对后得到74个共有基因，其中肉苁蓉和迟发性性腺功能减退的潜在基因有71个，巴戟天和迟发性性腺功能减退的潜在基因有14个，“肉苁蓉–巴戟天”迟发性性腺功能减退症的潜在作用基因有74个，见图1。

图1. 肉苁蓉–巴戟天与LOH的交集基因

3.3. 肉苁蓉–巴戟天药对干预迟发性性腺减退症核心靶点筛选以及网络互作关系构建

在Cytoscape3.9.0软件安装的CytoHubba插件，计算各网络节点的拓扑性质参数(介数、自由度、接近中心性、平均最短路径长度)，以所有节点这四个参数的中值作为筛选条件，取大于其二倍中位数度值12的靶点作为中心靶点。结果显示，该蛋白互作网络中74个靶点通过224条边相连接，关键靶点13个，包括JUN、MAPK1、TP53、AKT1、FOS、TNF、ESR1、IL6、EGFR、MYC、STAT1、HIF1A、RB1，以此为基础建立PPI网络图，以节点颜色深浅表现连接度大小，可视化结果见图2，关键靶点信息具体情况见表2。

图2. 肉苁蓉–巴戟天药对干预LOH核心靶点PPI网络图

表2. “肉苁蓉–巴戟天”干预迟发性性腺功能减退中心靶点的网络拓扑学参数

在Cytoscape3.9.0软件绘制中药–成分–潜在作用靶点肉苁蓉–巴戟天网络图，该网络有90个节点，包括槲皮素(quercetin)、β谷甾醇(beta-sitosterol)、内酯(suchilactone)等16个有效成分；钠离子通道α (SCN5A)、类视黄醇X受体(RXRA)、特异性钾离子通道蛋白抗体(KCNH2)、等16个药物靶点，并通过106条边相连接，充分说明肉苁蓉巴戟天具有多成分、多靶点共同作用，以对迟发性性腺功能减退症达到干预的目的，见图3。

图3. “肉苁蓉巴戟天”药对–化学成分–潜在靶点网络图

3.4. 肉苁蓉–巴戟天药对干预迟发性性腺减退症GO通路富集分析

将肉苁蓉-巴戟天干预迟发性性腺功能减退潜在作用靶点导入DAVID6.8数据库，对74个交集靶点进行GO富集分析以P < 0.05为筛选条件得到493条相关通路。其中生物学过程(BP)通路375条；细胞组成(CC)通路37条；分子功能(MF)通路81条。以P值排序，各取其前20条通路，用R软件绘制气泡图，见图4~6。

图4. GO-BP富集分析

图5. GO-CC富集分析

图6. GO-MF富集分析

生物学过程，细胞组分，分子功能结果前10个条目主要包括：蛋白质磷酸化的正向调控(positive regulation of protein phosphorylation)；缺氧反应(response to hypoxia)；染色质(chromatin)；高分子复合物(macromolecular complex)；线粒体(mitochondrion)；锌离子结合(zinc ion binding)；转录因子结合(transcription factor binding)等。

3.5. 肉苁蓉–巴戟天的潜在作用靶点KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8数据库对74个“肉苁蓉–巴戟天”的潜在作用靶点进行KEGG富集分析，共得到159条相关通路，以P < 0.05为筛选条件，得到151条相关通路。取其前20条，用R软件绘制气泡图，见图7，各数值表现方法同GO通路表现。

KEGG部分前20位信号通路包括：癌症的途径(Pathways in cancer)；化学致癌–受体激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)；脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)；丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)；糖尿病并发症中的RAGE信号通路(RAGE signaling pathway in diabetic complications)；缺氧诱导因子1信号通路(HIF-1 signaling pathway)；肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)；非洲锥虫病(African trypanosomiasis)等。

4. 讨论

临床上部分LOH患者血清睾酮水平降低程度与症状体征严重程度并不完全吻合，目前对睾酮补充治疗(testosterone supplementation therapy, TST)的标准值尚未达到共识，这些都为中医药干预LOH提供了可能 [14]。《千金翼方》记载：“人五十以上，阳气日衰，损与日至……心无聊赖，健忘嗔怒，情性变异，食欲无味，寝处不安”与LOH症状基本吻合。《素问·上古天真论》曰：“五八，肾气衰，六八，阳气衰竭于上，七八，肝气衰，八八，天癸竭，精少，肾脏衰”LOH相当于男子“六八”至“八八”的年龄段，天癸竭、肾气衰是其致病之本，但LOH临床证型肾虚证并非唯一，其往往兼肝郁、脾虚、心血不足，最终导致阴阳失调，脏腑功能紊乱而发病 [15]。肾藏精，司气化，内寓真阴真阳，一身阳气有赖肾阳温煦；益精填髓精足上充于脑，则髓海充足神志清明。

图7. GO-KEGG富集分析

本研究初步筛选肉苁蓉巴戟天有效成分22个，干预LOH的核心靶点有13个，化合物–疾病–靶点调控网络表明肉苁蓉–巴戟天药对干预LOH作用机制复杂多样且靶点众多。药理研究表明肉苁蓉具有缓解衰老、抗疲劳、平衡免疫、保护肝功能、促进生殖等方面的作用 [16]；巴戟天具有抗骨质疏松、延缓衰老、平衡机体免疫、缓解抑郁、缓解心肌缺血、促进生殖功能等作用 [17]。肉苁蓉–巴戟天药对有效成分中均含有大量槲皮素及β-谷甾醇。槲皮素具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抑制免疫应答、抗抑郁等多种药理作用 [18] [19]；睾丸间质细胞(leydigcells, LCs)在下丘脑–垂体–睾丸间质细胞轴调控下产生睾酮 [20]，槲皮素促进骨髓间充质干向睾丸间质细胞分化，从而槲皮素对雄性激素分泌具有直接或间接的影响作用 [21] [22]。β-谷甾醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、调节免疫、抗衰老作用 [23] [24]。慢性炎症可能通过直接调节睾丸间质细胞功能而下调雄性激素的生成 [25]，炎性细胞因子TNF、IL1β和IL6导致TM3睾丸间质细胞类固醇生成的剂量依赖性下降，而β-谷甾醇能有效抑制包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6在内的炎症反应，并使促炎症细胞因子的水平下降 [26] [27]。C-JUN能促进人绒毛膜促性腺激素(Hcg)诱导下，体外培养的大鼠LC的睾酮分泌 [28]；C-FOS参与HCG诱导大鼠LC睾酮的分泌，其途径很可能是通过cAMP-PKA通路来表达 [29]。热敏感有可能通过扰乱支持生殖细胞粘附链接动力学，激活睾丸支持细胞中MAPK1/3，并促进生殖细胞凋亡 [30]。在MDM2/TP53介导下，可以导致类固醇生长因子1 (Nr5a1)消融诱导的细胞凋亡，从而控制支持细胞的细胞周期 [31]。实验表明LC通过PI3K/Akt信号通路的激活可产生睾酮，而镍可能对其有抑制作用 [32]；全氟十一烷酸(PFUnA)抑制LH分泌，导致AKT1低磷酸化，并诱导ROS导致AKT1、ERK1/2低磷酸化，从而抑制LC增殖，直接或间接导致睾酮分泌减少 [33]；雌激素通过雌激素受体1 (ESR1)抑制LC介导的类固醇产生，从而抑制睾酮分泌 [34]。表皮生长因子(EGF)与其受体(EGFR)结合，促进睾丸间质干细胞增殖并向睾丸间质细胞方向的分化，直接或间接促进睾酮分泌 [35]；而在睾丸间质细胞、管周肌样细胞中MYC高度表达，能有效稳定睾丸干细胞生态 [36]；据相关研究报道，Jak1/Stat1通路在lncRNA-XIST分泌的miR-142-5p作用下，通过YY1、NFkB调节类固醇生成3β-HSD、StAR，导致睾丸间质细胞中睾酮的产生受到抑制 [37]；HIF可以调节小鼠KK1颗粒细胞中的cJUN表达，并参与调节P-CREB向STAR启动因子的募集 [38]。相关研究报道，Rb1能有效改善血管内皮功能障碍、抑制炎症或衰老；并且发现Rb1在前列腺癌细胞中对睾酮有拮抗作用；在VSMC中Rb1通过雄激素受体发挥雄激素样作用，从而防止血管钙化 [39]。

GO分析表明“肉苁蓉–巴戟天”干预LOH涉及多个生物过程，如药物反应、线粒体、蛋白质结合、酶结合等。KEGG通路富集分析显示丝裂原活化蛋白激酶信号通路；糖尿病并发症中的RAGE信号通路，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、缺氧诱导因子1 (HIF-1)信号通路、糖尿病并发症中的RAGE信号通路等，这些通路都可能是“肉苁蓉–巴戟天”干预LOH的主要通路。糖尿病睾丸间质细胞中miR-504、miR-935过度表达，通过抑制MAPK通路调节间质细胞增殖、凋亡，从而影响雄性激素分泌、精子形成 [40]；T3刺激LC通过类固醇、HIF-1α产生VEGF，VEGF反过来刺激睾丸间质细胞增殖和睾酮分泌 [41]。RAGE通路导致NF-κB活化，刺激细胞因子、生长因子产生，导致慢性炎症和癌症进展 [42]；慢性炎症导致睾丸中支持和间质细胞功能进行性下降，是睾酮下降的原因之一 [43]。研究表明TNFα通路促成了LC中睾酮生物合成的障碍，从而导致了雄性动物中睾酮激素的减少 [44]。

LOH为本虚标实之症，肾精不足为本，肝郁为标。肾藏精，主脏腑气化，肾精化肾气，肾气分阴阳，肾精肾气充盛则筋骨强，身体壮实；精生髓，肾精充足则髓海得养，思捷敏锐，精力充沛。肝藏血，肝主疏泄，条畅情志，《灵枢平人绝谷》曰：“血脉和利，精神乃居。”肝气疏泄，气血调和则情志舒畅 [45]。水谷精微化生肾精、肝血，精与血又可互相化生，因此可称为肝肾同源； [46] 《医通诸血门》云：“精不泄，归精于肝而化清血。”肾精溢于肝化生为血，血归于脉道滋养于肾。《素问·生气通天论》曰：“骨髓坚固，气血皆从”可见精与髓，是化生血液的重要物质基础。有关文献报道维生素D (Vitamin D)轴及VitaminD-FGF23-Klotho轴对造血功能有干预作用，其功能可能与“肾主骨生髓”中医论相对应；而相关动物实验表明，VD水平及其活性与动物衰老相关，运用补肾药物可使其升高；这与VitaminD-FGF23-Klotho轴与造血功能相互作用相关，可能是“精血同源”理论的现代生物学本质 [47]。血管内皮生长因子能促进血管生成，而睾丸间质细胞及支持细胞产生的血管内皮生长因子，还能调控睾酮及生精细胞分化 [48]。研究发现补肾中药可促进生殖器官血管生成及VEGF表达 [49] [50]。《药鉴》曰：“肉苁蓉俊补精血。”，《玉楸药解》曰：“巴戟天温补精血，滋益宗筋。”“肉苁蓉–巴戟天”相须为用可提高温肾补精之功，取精聚为髓，髓化生为血，血脉合利，精神乃居之目的。中医理论中的“肾”和现代医学的“下丘脑–垂体–性腺”生殖轴基本相似，而肝肾同源理论又与“神经–内分泌–免疫系统”功能相似 [8] [51]。基于网络药理学肉苁蓉–巴戟天药对干预LOH发现，肉苁蓉–巴戟天药对可通过对睾丸间质细胞及支持细胞的调节，促进血管内皮生长因子的分泌及生成并产生睾酮，从而产生类雄性激素样作用 [9]，而且还具有疏肝解郁抗抑郁的作用 [52]。

5. 结论

综上所述，基于网络药理学及肝肾同源中医学理论发现肉苁蓉–巴戟天药对干预LOH具有活性成分及作用靶点多样、作用途径广泛的特点，主要靶点包括：JUN、MAPK1、TP53、AKT1、FOS、TNF、ESR1、IL6等，涉及生物学通路包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、缺氧诱导因子1 (HIF-1)信号通路、糖尿病并发症中的RAGE信号通路等可通过对睾丸间质细胞及支持细胞的作用而影响睾酮分泌，本研究为后续针对肝肾同源及“肉苁蓉–巴戟天”干预LOH研究提供了有力的依据及参考方向。

值得注意的是，此研究不足之处在于：① 条件受限，无法测出药物在体内的代谢过程以及发生的一系列化学反应，② 数据库可能不够完备，有些成分可能尚未发现，③ 药物的含量及浓度和挥发度欠缺，因此仅作为机制预测方向，具体药物机制与中医理论相结合还需要进一步实验研究。

基金项目

黑龙江省中医药学会青年中医药科技创新项目(ZHY19-014)。

文章引用

任慧杰,安立文,郭玉岩,李洪涛,陈昕昕,高 山. 基于网络药理学及肝肾同源理论探讨肉苁蓉-巴戟天干预迟发性性腺功能减退症作用机制
Study on the Mechanism of Cistanches Herba and Morindae Officinalis Radix Intervening Late-Onset Hypogonadism Based on Network Pharmacology and the Theory of “Homogeny of Liver and Kidney”[J]. 临床医学进展, 2022, 12(08): 7449-7461. https://doi.org/10.12677/ACM.2022.1281076

参考文献