Hans Journal of Food and Nutrition Science
Vol. 08  No. 04 ( 2019 ), Article ID: 32929 , 12 pages
10.12677/HJFNS.2019.84036

Determination of Ten Kinds of Distyrene Styrene Fluorescent Whitening Agents in Flour and Starch by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector

Yan Liu1, Junchao Li2, Qingqing Qiao1, Runxin Wei1, Youyou Bo1, Sheng Wang3, Shasha Chen1

1Henan Product Quality Supervision and Inspection Institute, Zhengzhou Henan

2hengzhou Huatao Testing Technology Co. Ltd., Zhengzhou Henan

3Zhengzhou Tobacco Research Institute, Zhengzhou Henan

Received: Oct. 25th, 2019; accepted: Nov. 6th, 2019; published: Nov. 13th, 2019

ABSTRACT

A method for the determination of distyrene styrene fluorescent whitening agent in flour and starch by reverse phase high performance liquid chromatography with fluorescence detector was developed. The HPLC method was performed on column of Agilent XDB-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) by gradient elution using methanol and 0.02 moL/L ammonium oxalate solution as the mobile phases, and detected by the fluorescence detector at an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 430 nm. The experimental results indicated that the ten kinds of distyrene styrene fluorescent whitening agents were separated well. Under optimized test conditions, the linear ranges of the method for FWA210, FWA220, FWA264, FWA353, FWA85, FWA113, FWA357, FWA5bm, FWA134, FWA71 were 0 to 200 μg/L, respectively. The correlation coefficients for all 10 target compounds were higher than 0.999. The limits of detection (LOD) (S/N = 3) were 0.020 mg/kg, 0.020 mg/kg, 0.020 mg/kg, 0.020 mg/kg, 0.020 mg/kg, 0.020 mg/kg, 0.010 mg/kg, 0.010 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.005 mg/kg for FWA210, FWA220, FWA264, FWA353, FWA85, FWA113, FWA357, FWA5bm, FWA134, FWA71, respectively. The limits of quantification (LOQ) (S/N = 10) were 0.050 mg/kg for FWA210, FWA220, FWA264, FWA353, FWA85, FWA113, FWA357, FWA5bm and 0.050 mg/kg for FWA134, FWA71, respectively. The recoveries rate were between 80.2%~99.4% for 5~1000 µg/kg additive levels and the relatively standard deviations (RSD, n = 6) were between 1.8%~6.7%. The proposed method was simple, accurate, high recovery rate, sensitive for determination of 10 kinds of illegally added distyrene styrene fluorescent whitening agents in grain processing products such as flour and starch.

Keywords:Distyrene Styrene Fluorescent Whitening Agent, High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detection, Flour, Starch, Illegal Addition

反相高效液相色谱–荧光检测法测定面粉、淀粉中10种二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂

刘燕1,李俊超2,乔青青1,卫润鑫1,薄尤优1,王昇3,陈莎莎1

1河南省产品质量监督检验院,河南 郑州

2郑州华测检测技术有限公司,河南 郑州

3郑州烟草研究院,河南 郑州

收稿日期:2019年10月25日;录用日期:2019年11月6日;发布日期:2019年11月13日

摘 要

建立了反相高效液相色谱-荧光检测法检测面粉、淀粉中二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂的方法。样品经过混合溶液(水 + 甲醇 + 三乙胺)超声提取后,以C18反相柱(Agilent XDB -C18 250 mm × 4.6 mm, 5 µm)进行分离,甲醇与四丁基溴化铵溶液为流动相,梯度洗脱,同时采用荧光检测器进行检测,有效分离了10种二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂。在最佳实验条件下,FWA210、FWA220、FWA264、FWA353、FWA85、FWA113、FWA357、FWA5bm、FWA134、FWA71的线性范围在0~200 µg/L,相关系数均大于0.999,10种二苯乙烯类阴离子型荧光增白物质的方法检出限分别为0.020 mg/kg、0.020 mg/kg、0.020 mg/kg、0.020 mg/kg、0.020 mg/kg、0.020 mg/kg、0.010 mg/kg、0.010 mg/kg、0.005 mg/kg、0.005 mg/kg。FWA210、FWA220、FWA264、FWA353、FWA85、FWA113、FWA357、FWA5bm八种物质方法定量限为0.050 mg/kg,FWA134、FWA71两种物质方法定量限为0.020 mg/kg。添加水平在10~1000 µg/kg时,样品的回收率在80.2%~99.4%,样品的相对标准偏差(RSD, n = 6)在1.8%~6.7%间。该方法前处理简单、灵敏度高、回收率高、精密度好,适用于面粉、淀粉等粮食加工品中10种非法添加的二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂的测定。

关键词 :二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂,反相高效液相色谱–荧光检测,面粉,淀粉,非法添加物

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1. 引言

二苯乙烯类荧光增白剂(FWAs)是一种含有共轭双键、具有良好平面性的特殊结构的复杂有机化合物,也称光学增白剂。这类物质具有高荧光量子产率、高化学稳定性和优良的水溶性,能吸收紫外光,进而激发出可见的蓝色或蓝紫色荧光,其优异的增白性使其被广泛应用于纺织、洗涤、造纸、颜料、塑料、油漆等领域 [1]。二苯乙烯类荧光增白剂是二苯乙烯共轭体系延长的衍生物,常见的侧链中引入的有苯并噁唑基团、三嗪基团、磺酸基团、氰基、烯键等基团 [2]。不同基团的引入,使二苯乙烯类荧光增白剂具有不同的耐酸性、耐摩擦、耐晒特性。优良的增白效果使二苯乙烯类荧光增白剂占有荧光增白剂市场80%的市场份额。但与此同时,来自环境、土壤、水、塑料包装、纸质包装中的二苯乙烯类荧光增白剂对粮食作物、食品污染的问题,不法商贩为牟取私利向生鲜猪肉、菇类制品中添加荧光增白剂带来的食品安全问题引起大众的广泛关注。二苯乙烯类荧光增白剂(FWA)普遍含有苯乙烯基结构和芳香胺结构,能较为活跃地迁移到角质层或者血液中去,对人体具有潜在的致癌性。王天娇 [3] 等人应用UPLC-FLD技术检测出蘑菇、杏鲍菇、金针菇含有FWA 5bm、C.I.133、C.I.353、C.I.220、C.I.357、C.I.210、C.I.264等荧光增白剂。李蓉 [4] 等人应用高效液相色谱–三重四极杆质谱法检测出面粉中含有FWA135、FWA184 、FWA185、FWA393荧光增白剂。杜志峰 [5] 等人应用高效液相色谱–三重四极杆测定出发泡塑料餐具中存在5种荧光增白剂的迁移,用其盛放食物存在荧光增白剂污染的隐患。吴钟玲 [6] 等人利用高效液相色谱法测定食品接触聚苯乙烯中存在9种荧光增白剂的迁移,用其盛放的食品安全性令人堪忧。

欧盟法规2002/72/EC和新版《GB9685-2016食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准》明确规定食品接触材料中FWA184特异性迁移量(SML)不大于0.6 mg/kg,纸包装类食品包装材料不允许使用荧光增白物质 [7]。但是,目前的实际情况是食品包装材料国家监督抽查不抽检包装有食品的预包装产品的外包装,从某种角度上讲并不能如实地监督到食品所用包装材料的质量安全情况,监测部门也缺乏食品包装材料对食品造成污染的风险因子积累与风险数据的分析研判 [8]。目前,国内外对二苯乙烯类荧光增白剂的检测方法主要采用紫外灯法 [9] 、紫外分光光度计法、荧光分光光度计法、液相色谱法、液相色谱–荧光检测法 [10] - [15] 、毛细管电泳法、拉曼光谱、液相色谱串联三重四极杆法 [4] [16] [17]。紫外灯检测只能定性检测,荧光分光光度法只能定量测定却不能区分FWAs的种类,液相色谱串联三重四极杆法检测成本高且适合痕量物质的检测。液相色谱作为检测实验室常用的一种设备,价格适中,配备上荧光检测器具有较高的灵敏度,适合食品中荧光增白剂物质的检测。本研究选择10种常见的二苯乙烯类荧光增白剂物质FWA220 (CAS:16470-24-9)、FWA210 (CAS:28950-61-0)、FWA264 (CAS:76482-78-5)、FWA353 (CAS:55585-28-9)、FWA85 (CAS:12224-06-5)、FWA113 (CAS:12768-92-2)、FWA357 (CAS:41098-56-0)、FWA5bm (CAS:13863-31-5)、FWA134 (CAS:3426-43-5)、FWA71 (CAS:16090-02-1)作为研究对象,结合其光学特性,使用高效液相色谱法分离,配合荧光检测器检测,建立了面粉、淀粉中二苯乙烯类荧光增白物质的快速检测方法,该方法操作简单、可靠,适合大批量样品的筛选与检测。

2. 材料与方法

2.1. 材料与试剂

10种FWAs标准物质:FWA113、FWA264 (CATO),FWA220 (源叶生物),FWA353、FWA210、FWA71 (ANPEL),FWA357、FWA5bm (IL)、FWA134、FWA85 (MANHAGE)。

甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、四氢呋喃(色谱纯)购于TEDIA;

三乙胺(色谱纯)、氨水(色谱纯)、乙二胺(色谱纯)购于科密欧;

四丁基溴化铵(色谱纯)购于MACKLIN;三乙基苄基氯化铵、四丁基硫酸氢铵购于国药集团化学试剂公司。

提取混合溶液:甲醇、水、三乙胺(60+39+1)体积混合。

2.2. 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪:配有2475FLR荧光检测器;

SB-25-12DT超声波发生器:宁波新芝生物科技股份有限公司;

QL-866涡旋混合器:海门市其林贝尔仪器制造有限公司;

XA205DV天平:感量分别为0.000 1 g,梅特勒;

RE-52B旋转蒸发仪;

CT 14RD TECHCOMP离心机;

JFSD-100搅碎机;

DCY-24G氮吹仪;

Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计;

Agilent XDB -C18 250mm×4.6mm,5µm柱;Diamonsil C18 250mm×4.6mm 5µm柱。

2.3. 方法

2.3.1. 标准溶液的制备

标准储备液:称取适量各标准样品FWA210、FWA220、FWA264、FWA353、FWA85、FWA113、FWA357、FWA5bm、FWA134、FWA71,用体积百分比0.1%三乙胺溶液分别配制成浓度为100 mg/L的标准储备液,0℃~4℃避光保存。有效期3个月。

混合标准系列工作溶液:吸取适量每种标准储备溶液,用提取液稀释成1.00 mg/L的混合标准工作溶液,0℃~4℃避光保存。有效期3个月。继续吸取适量混合标准工作溶液,用提取液配制成浓度为0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L的标准系列工作液,临用时配制。

2.3.2. 试样处理

1) 制备

取500 g面粉或者淀粉样品,用捣碎机充分捣碎混匀,均分成两份,分别装入洁净容器作为试样,密封,并标明标记。将试样置于避光处保存。

2) 样品前处理

准确称取1 g试样(精确至0.01 g)置于塑料离心管中,加入提取液10 mL,涡旋震荡1 min,超声提取10 min后,用4000 r/min离心5 min,取上层清液,0.45 μm微孔滤膜过滤后进液相色谱仪进行分析。

2.3.3. 液相色谱操作条件

色谱柱:C18柱,250 mm × 4.6 mm (i.d.),5 μm

流动相:流动相A相为甲醇,B相为0.025 moL/L的四丁基溴化铵(TBA)溶液,流动相梯度洗脱条件如表1

Table 1. Instrument gradient elution setting

表1. 仪器梯度洗脱设置

流速:1.0 mL/min。柱温:30℃。检测器:激发光波长350 nm,发射光波长430 nm。进样量:20 µL。

2.3.4. 分析步骤

将2.3.1中的标准系列工作溶液分别按照液相色谱参考条件2.3.3进行测定,得到相应的标准溶液色谱峰的面积,以标准工作溶液浓度为横坐标,以色谱峰的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。同时,将试样溶液按照色谱条件进行测定,得到相应的样品溶液色谱峰面积,根据标准曲线得到待测液中目标物的浓度,平行测定次数两次。

3. 结果与分析

3.1. 检测波长的选择

本实验中所采用的荧光增白剂标准物质均具有三嗪基氨基二苯乙烯阴离子结构,以水溶液做空白液体,对0.10 mg/L标准溶液进行荧光光谱扫描。选取350 nm为激发波长进行扫描,获得最佳发射波长,再固定最佳发射波长对激发波长进行扫描,获得最佳的发射波长和激发波长。十种物质最大激发波长和发射波长基本一致,故经过荧光光谱扫描,选取350 nm为激发波长,选取430 nm为发射波长进行定量测定。具体见图1

Figure 1. Absorption and emission wavelengths from 0.10 mg/L Standard concentrations of FWA210, FWA220, FWA264, FWA353, FWA85, FWA113, FWA357, FWA5bm, FWA134, FWA71

图1. 0.10 mg/L标准浓度的FWA210、FWA220、FWA264、FWA353、FWA85、FWA113、FWA357、FWA5bm、FWA134、FWA71的吸收波长和发射波长

3.2. 调节酸碱度(pH)提取液试剂的选择

本实验中,分别考察无机氨水、乙二胺、三乙醇胺等碱性试剂配制提取液对标准物质和样品分析的影响。通过测定结果发现,荧光增白剂在含有机胺的提取液中更稳定,其在流动相中峰形要比无机氨水作为提取液的峰形更加对称,且不发生拖尾现象。原因在于有机胺可以更加有效地与C18柱上固定相的硅羟基结合紧密,使固定相的吸附、解吸附性能更强。查得资料显示,在工业生产中,三乙醇胺是荧光增白剂常用的稳定剂,所以该实验选择三乙醇胺作为提取液的酸碱度调节剂。

3.3. 离子对试剂作为流动相的选择

本实验考查的碱性离子对试剂有四丁基溴化铵、三乙基氯化铵、四丁基硫酸氢铵。烷基链的长度与荧光增白剂和固定相结合的强度成正比,与流动相的溶解度成反比。碱性条件时,阴离子型荧光增白剂以离子形式存在溶液中,即使有机溶剂含量很低,保留时间也相当短,如图2所示,以FWA220为例,出峰时间很短。离子对试剂中离子与被测物形成疏水性离子对,它具有较长烷基链大大增加和固定相的结合力,延迟了出峰时间,达到良好的分离效果。本实验选择烷基链长短居中的阳离子型四丁基溴化铵作为实验使用的离子对试剂。实验证明,即使有机相含量高达60%~70%的情况下,荧光增白剂FWA220的出峰时间也能控制在5~7 min,有效地与杂质进行了分离。同时考查离子对试剂浓度对荧光增白剂出峰情况的影响,发现随着离子对试剂浓度的增加,保留时间增加,当离子对试剂达到一定浓度时,保留时间变化不大,本实验考虑到离子对试剂在高浓度有机流动相条件下易产品盐析现象,所以最后选择离子对试剂最佳使用浓度在0.025 moL/L。

Figure 2. Chromatography of styrene fluorescent whitening agent FWAS 220 when ion pair reagent is not used in mobile phase

图2. 流动相未使用离子对试剂时荧光增白剂的色谱图

3.4. 分离条件的优化

本实验所用设备高效液相色谱中选择使用的有机流动相有三种,分别是四氢呋喃、乙腈、甲醇。经实验证明使用四氢呋喃作为流动相时,FWA113与FWA357不能完全基线分离,FWA5bm与FWA134不能完全基线分离。用纯乙腈作为流动相,色谱峰和甲醇同样都能够实现基线分离,但是色谱峰拖尾较为严重,影响精密分析的要求。Agilent XDB -C18 250 mm × 4.6 mm,5µm柱与Diamonsil C18 250 mm × 4.6 mm 5 µm柱对比,Agilent XDB -C18 250 mm × 4.6 mm,5 µm柱的峰形与分离度良好。考查不同梯度条件后,2.3.3节中的洗脱条件下可获得最佳分离效果。10种荧光增白剂混合标准溶液的分离色谱图如图3所示。

1-FWA210,2-FWA220,3-FWA264,4-FWA353,5-FWA85,6-FWA113,7-FWA357,8-FWA5bm,9-FWA134,10-FWA71

Figure 3. High performance liquid chromatography from 10 µg/L Standard concentrations of FWA210, FWA220, FWA264, FWA353, FWA85, FWA113, FWA357, FWA5bm, FWA134, FWA71

图3. 浓度为10 µg/L荧光增白剂标准溶液的高效液相色谱图

3.5. 线性关系、检出限和定量限(表2)

Table 2. Linear relationships, limits of detection (LOD, S/N = 3) and limits of quantification (LOD, S/N = 10) of the analytes

表2. 目标物的线性关系与检出限、定量限

y: peak area; x: mass concentration, mg/L

3.6. 方法回收率和精密度

取空白样品进行加标测定回收率和精密度。准确称取空白面粉、淀粉样品1 g,分别添加高、中、低3个水平的混合标准溶液,按照2.3.2. 2)样品处理方法平行处理,并按照2.3.3节色谱条件进行检测,每一加标水平平行测定6次,计算平均回收率。得到10种目标组分(FWA210、FWA220、FWA264、FWA353、FWA85、FWA113、FWA357、FWA5bm、FWA134、FWA71)的加标回收率和精密度,结果见表3。在不同的加标水平下,10种目标化合物回收率稳定,精密度良好,可以满足样品中10种FWAs测定的分析要求。

Table 3. Recoveries and precision of 10 FWAS from flour samples

表3. 10种目标物的方法回收率和精密度

3.7. 实际样品的分析

应用所建立的方法对市场上40批次的预包装面粉、10批次预包装淀粉以及15批次散装面粉、10批次散装淀粉进行检测,发现1批次散装面粉中有FWA71检出,含量在0.022 mg/kg,该物质的检出可能来自环境的污染,同时不排除人为非法添加的。

4. 讨论

本文建立了面粉、淀粉等十种食品中二苯乙烯类荧光增白剂的高效液相色谱检测方法,该方法填补了国家标准中面粉、淀粉制品中违法添加二苯乙烯类荧光增白剂定量检测的方法空白,增加了技术储备。该方法前处理简单、准确、灵敏,方法的重现性和线性关系均能满足定量分析要求。由于二苯乙烯类荧光增白剂在日常生活中应用广泛,塑料、洗涤、纸包、纺织、染料等领域均能接触到,也易造成环境污染,直接影响消费者的食品安全和人身健康。因此,监督部门应针对该情况加强对食品及农产品中二苯乙烯类荧光增白剂的检验监管工作。

基金项目

河南省科技攻关项目,项目编号152102310429。

文章引用

刘 燕,李俊超,乔青青,卫润鑫,薄尤优,王 昇,陈莎莎. 反相高效液相色谱–荧光检测法测定面粉、淀粉中10种二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂
Determination of Ten Kinds of Distyrene Styrene Fluorescent Whitening Agents in Flour and Starch by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector[J]. 食品与营养科学, 2019, 08(04): 273-284. https://doi.org/10.12677/HJFNS.2019.84036

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