青岛大学附属青岛市市立医院，山东 青岛

收稿日期：2022年2月3日；录用日期：2022年2月18日；发布日期：2022年3月4日

摘要

目的：分析类风湿关节炎(RA)患者、功能便秘(FC)患者、健康人群(HC)肠道菌群结构及血清5-羟色胺(5-HT)水平差异，初步探讨肠道菌群在RA合并FC发病中的作用。方法：选取90例研究对象(其中类风湿关节炎患者组——RA组30例，功能性便秘患者组——FC组30例、健康对照组——HC组30例)，并收集三组新鲜粪便标本，然后利用Illumina MiSeq平台对三组样本16SrRNA基因序列V3~V4高变区进行PCR扩增及测序，进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析及门属水平上的菌群差异性分析，用LEfSe聚类分析法得到各组代表性差异肠道菌群。应用ELISA法检测各组血清5-HT水平，对连续变量资料采用方差分析。结果：属水平，FC与RA组Prevotella_9较HC增多，拟杆菌属(Bacteroides)、(Agethobacter)均减少。PCoA分析提示RA组菌群差异明显大于FC及HC组。LEfSe分析寻找组间代表性菌属，RA组g_Prevotella_9、s_uncultureda-bacterium_g_Prevotella_9、f_Prevotellaceae、o-Enterobacteriales、f-Enterobacteriaceae；FC组为p_Firmicutes、s_Megasphaera_micronuciformis，差异有统计学意义(LDA值均大于4)。PICRUSt软件进行功能基因预测分析得到，RA组在淀粉和蔗糖代谢、二级胆汁酸生物合成、RNA转运等方面均低于HC组。FC与HC组无明显比较无明显差异。ELISA法检测分析，FC与RA组5-HT水平较HC组明显降低，差异有统计学意义(P < 0.0001)。结论：RA可通过肠道菌群调节肠道神经递质水平从而影响胃肠道功能，可能与5-HT依赖途径作用于c-kit及其配体干细胞因子途径(SCF/C-kit通路)、肠道菌群代谢产物作用等方面相关。

关键词

肠道菌群，类风湿关节炎(RA)，功能性便秘(FC)，5-HT

Difference of Intestinal Flora and Analysis of Serum 5-Hydroxytryptamine in Patients with Rheumatoid Arthritis and Functional Constipation

Ruixia Tang, Qian Xing^*

Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Qingdao University, Qingdao Shandong

Received: Feb. 3^rd, 2022; accepted: Feb. 18^th, 2022; published: Mar. 4^th, 2022

ABSTRACT

Objective: To analyze the structural differences of intestinal flora and 5-hydroxytryptamine (5-HT) level in patients with rheumatoid arthritis (RA), patients with functional constipation (FC), and healthy people. And to explore the role of intestinal flora in the pathogenesis of RA combined with FC. Method: Collecting 90 subjects (rheumatoid arthritis patients group—RA group 30 cases, functional constipation patients group—FC group 30 cases, healthy control group—HC group 30 cases), and their fecal samples. And then use Illumina MiSeq platform to amplify and sequence the V3~V4 hypervariable region of 16SrRNA gene sequence using PCR, and analyze Alpha diversity, Beta diversity and the difference of intestinal flora at phylum and genus level. LEfSe clustering analysis was used to find the representative intestinal flora of each group. ELISA was used to detect the levels of serum 5-HT in each group, and analysis of variance was used for constinuous variable data. Results: at the level of genus, Prevotella_9 increased, Bacteroides and Agethobacter decreased in RA and FC groups compared with HC group. PCoA analysis showed the difference of intestinal flora in RA group was significantly greater than that in FC and HC groups. LEfSe analysis was performed to find the representative bacteria in different groups: g_Prevotella_9, s_uncultureda-bacterium_g_Prevotella_9, f_Prevotellaceae, o-Enterobacteriales, f-Enterobacteriaceae in RA group. p_Firmicutes, s_Megasphaera_micronuciformis in FC group. The difference was statistically significant (LDA values all greater than 4). PICRUSt software was used for functional gene prediction analysis, and it was found that RA group was lower than HC group in starch and sucrose metabolism, secondary bile acid biosynthesis, RNA transport and other aspects. There was no difference between FC and HC groups. ELISA method detected that the level of 5-HT in RA and HC groups was significantly lower than that in HC group (P < 0.0001). Conclusion: RA can regulate the level of intestinal neurotransmitters and affect gastrointestinal function through intestinal microflora, which may be related to the action on c-kit and its ligand stem cell factor pathway (SCF/C-kit pathway) and intestinal microflora metabolites and so on, through 5-HT dependent pathway.

Keywords:Intestinal Flora, Rheumatoid Arthritis (RA), Functional Constipation (FC), 5-HT

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1. 前言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种由异常的免疫激活与免疫耐受引起的自身免疫性疾病，其特征为滑膜炎、软骨损伤和骨破坏 [1]。目前关于RA的发病机制尚未明确，可能与遗传和内外环境因素共同作用有关。RA常常合并功能性便秘(functional constipation, FC)，其主要临床症状为周排便频次减少、排出费力、粪便性状干硬且难以排出、排便量少、排便时自觉直肠肛门堵塞感、需要手法辅助排便。研究发现便秘与多种疾病相关，目前我国一项关于便秘与过敏性鼻炎发病风险相关性队列研究，发现便秘可通过改变肠道微生物增加过敏性鼻炎发病风险 [2]。已知类风湿关节炎与过敏性鼻炎均以Treg细胞失衡相关，从而推测便秘可能与类风湿关节炎存在相关性。法国一项关于慢性腹泻与类风湿关节炎发病风险的队列研究发现RA发病风险与慢性腹泻相关，而与便秘或慢性腹泻/便秘交替无关 [3]。这两者得出的不同结论，可能与人种、饮食结构、环境等因素不同相关。美国一项小鼠实验发现，肠道菌群可通过5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)依赖的方式促进肠神经系统(enteric nervous system, ENS)的发育，并伴随肠道转运的变化 [4]。提示肠道菌群在胃肠动力中发挥重要作用。目前许多研究发现，RA及FC与肠道菌群相关，本研究将类风湿关节炎(RA)、功能性便秘(FC)、健康对照(HC) 3组间进行比较，观察各组间肠道菌群结构及5-HT水平变化。为寻求类风湿关节炎合并FC新的治疗靶点提供理论依据。

2. 对象与方法

2.1. 一般资料

2.1.1. 研究对象

将2021年01月~2021年11月期间纳入90例研究对象，按照疾病分为3组：RA组——类风湿关节炎组(30例)、FC组——功能性便秘组(30例)、HC组——健康对照组(30例)。经医院伦理委员会批准，患者自愿参与，且签署同意书。

2.1.2. RA标准

患者均符合2010年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟诊断标准。

2.1.3. FC诊断标准

根据2016年修订的罗马Ⅳ的诊断标准，患者存在≥上述2个症状即可诊断为FC，其中自发排便次数 < 3次/周可作为独立诊断指标，若便秘症状持续存在且病程 ≥ 6个月，临床上即可诊断为慢性便秘(chronic constipation, CC) [5]。

2.1.4. 健康人群标准

指未患有风湿免疫性疾病、影响肠道菌群疾病、排便异常、影响5-HT水平疾病的人群。

2.1.5. 纳入及排除标准

1) 体质量指数明显偏离在正常范围；2) 重叠其他风湿类疾病如系统性红斑狼疮、干燥综合征等；3)合并严重的肾、肝、心、脑和造血系统等严重疾病者；4) 合并精神疾病，胃肠炎及其他炎症性疾病和传染病，妊娠期及哺乳期妇女；5) 受试者8周内使用抗生素或益生菌治疗；6) 有特殊饮食习惯；7) 大剂量激素治疗者；8) 脊柱裂、脊髓畸形、先天性巨结肠等消化道器质性病变，糖尿病、甲状腺功能减退、皮肌炎及代谢性疾病等影响胃肠动力者；9) 伴影响体内5-HT水平的其他疾病，如SLE等其他结缔组织病、帕金森、舞蹈病、肝豆状核变性、精神分裂、神经衰弱等；10) 资料不完善者。

2.2. 一般资料

三组间在性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟、饮酒等一般资料无显著差异(P > 0.05)。三组间在每周自发排便次数上差异存在统计学意义(P < 0.001) (表1)。

2.3. 患者治疗

患者接受规范药物治疗，如口服免疫抑制剂(甲氨蝶呤7.5~12.5 mg∙qw)。

表1. 三组间一般资料比较

注：BMI为体质指数；SCMB次数为每周自发排便次数；^#P < 0.001，RA与FC组相比；^*P = 0.01，RA与HC组比较；^*P < 0.001，FC与HC组比较。

2.4. 肠道菌群测定

分别留取新鲜粪便样本，置于−80℃冰箱保存。提取标本4℃解冻，并与超纯水1:3稀释混合，制成粪便浆。使用ZR-96粪便DNA试剂盒，分离DNA。提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行高通量测序。对原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列(Tags)，并将优化序列进行聚类，依据相似性阈值为97%划分OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类。

2.5. 神经递质水平

收集研究对象晨起后的空腹肘静非抗凝血5 ml，静置15 min后，高速离心取上清液存于−80℃冰箱保存，应用ELISA法测定血清5-HT水平。

2.6. 统计方法

采用SPSS 21.0软件进行数据处理与分析。正态分布的连续变量以均值 ± 标准差( $\bar{X}\pm \text{s}$ )表示，三组间数据比较采用方差分析；计数资料采用计数数据比表示，数据比较采用卡方检验。肠道菌群测序资料通过R语言进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析、wilcox秩和检验进行组间差异显著性分析、主坐标分析(PCoA)、LEfSe分析、Spearman相关性分析(检验水准α = 0.05)。P < 0.05提示差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 神经递质水平差异

见表2，FC与RA组5-HT水平较HC组均明显降低，差异有统计学意义(P < 0.0001)。RA组与FC组血清5-HT水平无显著差异(P > 0.05)。

表2. 三组间血清5-HT水平

注：5-HT表示5-羟色胺；RA组为类风湿关节炎患者组；FC组为功能性便秘患者组；HC组为正常对照组；^***表示与HC组比较，^***P < 0.0001。

3.2. 组间肠道菌群差异比较

1) 对所有样本的有效数据以97%的一致性进行OTUs聚类，共得到477个OTUs。其中RA组453个OTUs，FC组432个OTUs，HC组454个OTUs。对其进行Alpha多样性分析，组间无差异(P > 0.05)。

2) 比较三组间菌群构成差异在门水平，RA组肠道菌群厚壁菌门(Firmicutes)/拟杆菌门(Bacteroidetes)，即F/B明显高于FC组与HC组；而RC组与HC组间F/B未见明显差异。RA组变型菌门(Proteobacteria)构成比多于FC组与HC组。FC组放线菌门(Actinobacteria)构成略低于RA组与HC组(图1)。属水平，FC组与HC组比较Prevotella_9、Megamonas、Dialister增加较显著；而拟杆菌属(Bacteroides)、Agethobacter减少。RA组相较HC组，Prevotella_9、大肠埃希菌属(Escherichia-Shigella)明显增加；而拟杆菌属(Bacteroides)、Megamonas、Agethobacter、Roseburia构成比偏低。综上，较HC组，FC与RA组Prevotella_9增多，拟杆菌属(Bacteroides)、(Agethobacter)均减少(图2)。

3) PCoA分析能直观表现出RA、FC、HC组的聚集倾向，表明RA组肠道菌群结构较FC及RA组存在明显差异(图3)。

4) LEfSe (Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)能够在组间寻找具有统计学差异的生物标志物(Biomarker)。RA组为g_Prevotella_9、s_uncultureda-bacterium_g_Prevotella_9、f_Prevotellaceae、o-Enterobacteriales、f-Enterobacteriaceae。FC组为p_Firmicutes、s_Megasphaera_micronuciformis；HC组不寻找差异菌。默认LDA值筛选值为4，LDA值大于4差异有统计学意义(图4)。进化分支图显示不同组差异菌分类级别及分支(图5)。

图1. 门水平物种分布柱状图

图2. 属水平物种分布柱状图

图3. PCoA图

图4. LDA值分布柱状图

图5. LEfSe分析进化分支图

3.3. 功能基因预测

使用PICRUSt软件通过比对16S测序数据获得的物种组成信息，推测样本中的功能基因组成，从而分析不同样本或分组之间在功能上的差异。通过KEGG代谢途径的差异分析，可以观测不同分组的样品之间微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异和变化，是研究群落样本为适应环境变化发生的代谢功能改变的有效手段。分析得到的结果如下图，该图为第三层级下KEGG代谢途径的相对丰度柱形图。PICRUSt软件分析得到，RA组在淀粉和蔗糖代谢、二级胆汁酸生物合成、RNA转运、半乳糖代谢、鞘脂类代谢、糖鞘脂生物合成–球蛋白与异球蛋白系列、肿瘤中央碳代谢等方面均低于HC组(图6)。FC与HC组无明显比较无明显差异。

图6. Level 3相对丰度柱形图

4. 结论

RA与FC的发病机制均尚未明确，依据目前的研究提示RA与FC均与肠道菌群失调存在联系，故本实验将类风湿关节炎组(RA组)、功能性便秘组(FC组)、健康对照组(HC组)三组间肠道菌群进行比较，从而分析RA与FC与肠道菌群的关系及是否存在相同及不同菌群变化趋势，即RA患者容易发生功能性便秘是否与肠道菌群存在关联。目前许多研究发现，便秘患者Prevotella菌 [6] 属较健康人群增多，Agethobacter菌、乳酸杆菌、Roseburia菌等 [7] 有益菌减少，通过破坏肠道菌群结构稳定，影响胃肠道运动功能；同时使有益菌对寡糖的酵解作用减弱，大量寡糖在肠道堆积，不利于粪便被推向肛门排出 [8] [9]，从而产生功能性便秘。而本研究发现RA患者与FC患者同时伴有Prevotella_9增多，及拟杆菌属(Bacteroides)、(Agethobacter)减少，且RA组升高及减少的程度均大于FC组，同时RA组还存在着大肠埃希菌属(Escherichia-Shigella)的明显增加及Megamonas、Roseburia菌的明显偏低，使RA组肠道菌群更加紊乱，从而更易导致功能性便秘。Megamonas菌属于杆菌，能产乙酸、丙酸、乳酸，促进肠蠕动，有研究发现Megamonas菌与RA相关 [10]。Roseburia菌产短链脂肪酸(丁酸)，具有抗炎作用，研究发现便秘、类风湿患者中Roseburia菌构成低 [7]。RA患者肠道菌群存在有益菌的比例减少及有害菌增高，存在与FC组相同的变化趋势，且差异较FC组更加明显。提示RA患者通过肠道菌群作用于胃肠道功能，从而产生相应消化道症状。

就作用机制而言，目前发现FC的发病与c-kit及其配体干细胞因子(stem cell factor, SCF)构成的信号途径，即SCF/C-kit通路相关。SCF/C-kit通路通过调节Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal, ICC)数量与表型，影响胃肠道平滑肌蠕动 [11]。ICC是胃肠道平滑肌的慢波起搏细胞，参与胃肠慢波起搏，慢波可决定消化道平滑肌的收缩节律，故又称基本电节律。慢波活动受自主神经的调节，主要与神经递质相关。神经激肽1 (neurokinin 1, NK1)、NK3、P物质(substance P, SP)、乙酰胆碱和5-羟色胺(5-hydroxy-tryptamine, 5-HT)，介导肠壁紧张性收缩，加速肠道运动；抑制性神经递质包括一氧化氮(nitric oxide, NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)，使肠壁松弛 [12]。

定居在人体胃肠道内的微生物中有许多有益菌，能产生细菌代谢产物–短链脂肪酸SCFAs，为肠道微生物通过发酵可溶性膳食纤维而产生的具有活性的代谢产物，是肠上皮细胞的重要营养物质，具有抗炎消肿、抗肿瘤、保护胃肠道屏障和增强胃肠道动力等作用。其增强胃肠道的作用，主要与改变肠道PH值，促进肠道来源神经递质(如5-HT)生成有关 [13]。当菌群失调时，肠道SCFAs产生减少，使肠道来源神经递质及代谢产物(如NO)产生减少，可能通过降低肠神经兴奋性，使Cajal间质细胞将神经信号转为电信号作用减弱，从而使胃肠肌肉收缩运动功能减弱，甚至产生便秘。5-HT是具有调节胃肠运动作用的神经递质，主要是由一种特殊的肠内分泌细胞(enteroendocrine cells, EECs)，即肠嗜铬细胞(enterochromaffin cells, ECs)分泌。肠道细菌可直接影响5-HT的代谢从而影响胃肠动力 [14]，莫沙必利可通过激动5-HT4受体，改善患者便秘症状。5-HT还可加速乙酰胆碱释放，而乙酰胆碱可作用于胃肠道平滑肌使其张力增加，最终可加快胃肠道的蠕动 [15]。Yano等发现GF小鼠结肠和血液中5-HT含量减少, 并伴有胃肠运动障碍 [16]。色氨酸羟化酶-1 (tryptophan hydroxylase, TPH1)是5-HT合成的关键限速酶,研究发现SCFAs还可以诱导人EC细胞模型中的TPH1表达并呈浓度依赖性 [13]，从而刺激肠粘膜释放5-HT，增加肠蠕动。目前许多动物实验证明，重建便秘患者肠道菌群，ICC中c-Kit/SP信号通路显著上调，从而改善便秘症状 [17] [18]。人体中5-HT约90%来自于胃肠道，本实验中通过检测三组间血清5-HT，间接反应肠道组织5-HT水平。发现RA组、FC组血清中5-HT水平均低于HC组，差异有统计学意义(P < 0.05)，提示肠道菌群可能通过调节5-HT水平，作用于SCF/C-kit通路，进而调节胃肠动力。有研究着通过将便秘和健康人的粪便菌液对无菌小鼠进行灌胃，发现用便秘组粪便菌液灌胃小鼠肠道组织的5-羟色胺转运体(SERT)表达降低，5⁃HT水平减低，肠道运动功能减弱 [19]。提示肠道菌群失调可能是通过改变了SERT表达而影响肠道运动功能进而导致便秘的发生。

肠腔内不能被小肠消化吸收的碳水化合物、蛋白质和肽类等物质在肠道微生物的发酵下形成了一些对肠道动力有调节作用的代谢产物，其主要包括胆汁酸类(bile acids, BAs)、短链脂肪酸(short-chain fattyacids, SCFAs)、硫化氢和甲烷。肠道微生物可调控BAs的代谢，其过程主要为肠道微生物内的特定菌株经发酵产生的代谢产物胆汁盐水解酶(bile salt hydrolases, BSHs)可将初级BAs代谢成次级Bas，影响物质吸收及胃肠蠕动 [20]。通过比较RA组与FC组，发现RA组肠道菌群构成则更加紊乱，且淀粉和蔗糖代谢、二级胆汁酸生物合成等代谢均低于HC组。提示RA组肠道菌群结果及功能紊乱，从而可能加重RA及引发其他并发症状。

综上所述，RA患者肠道菌群结构紊乱影响5-HT等神经递质的产生，从而通过作用于胃肠神经系统，使胃肠蠕动功能减弱，最终导致功能性便秘。为今后RA合并功能性便秘治疗，提供新的方向。另外，本研究所涉样本量较少、饮食习惯存在地域差别，需要多地域更大的样本量来进行证实研究。同时因获取人胃肠道组织标本困难，本实验未直接检测胃肠道来源5-HT水平，对于SCF/C-kit通路、Cajal间质细胞未进一步检测分析。因此，我们下阶段将优化实验方法及样本量，从不同的肠道菌群和代谢产物角度出发，通过改善肠道菌群结构从而为改善RA合并功能性便秘提供新的治疗思路。

文章引用

唐瑞霞,邢 倩. 类风湿关节炎与功能便秘患者肠道菌群差异及血清5-羟色胺分析
Difference of Intestinal Flora and Analysis of Serum 5-Hydroxytryptamine in Patients with Rheumatoid Arthritis and Functional Constipation[J]. 临床医学进展, 2022, 12(03): 1564-1573. https://doi.org/10.12677/ACM.2022.123225

参考文献