¹贵州中医药大学药物分析实验室，贵州 贵阳

²贵州民族大学中药资源与开发系，贵州 贵阳

收稿日期：2022年6月18日；录用日期：2022年7月15日；发布日期：2022年7月22日

摘要

目的：建立不同厂家不同批次一清颗粒UPLC指纹图谱分析方法，比较不同厂家之间指纹图谱的差异，为有效控制及质量评价不同厂家一清颗粒的质量提供有力依据。方法：采用ZORBAX RRHD Eclipse Plus C₁₈ (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)色谱柱，乙腈(A)-0.1%的甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱，检测波长为254 nm；流速为0.1 ml/min；柱温为30℃；进样量为1 μl。测定24批不同厂家的一清颗粒的指纹图谱，并对其结果进行相似度、系统聚类和主成分分析。同时对一清颗粒中的部分化学成分进行指认。结果：24批样品UPLC指纹图谱相似度在0.674~0.978之间，不同厂家一清颗粒成分存在差异，同一厂家一清颗粒质量较稳定。系统聚类分析将24批一清颗粒分为3大类，同一厂家之间聚为一类。且利用VIP值筛选出6个导致差异性的差异峰。同时指认出了大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、巴马汀等10个化学成分。结论：该方法简单、可靠、重复性及稳定性好，适用于不同厂家一清颗粒的质量控制。

关键词

一清颗粒，UPLC指纹图谱，质量评价

Study on UPLC Fingerprint of Yiqing Granules from Different Manufacturers

Qian Zeng^1*, Xulong Huang¹, Xiangpei Wang², Hongmei Wu^1#

¹Pharmaceutical Analysis Laboratory, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou

²Department of Resources and Development of Traditional Chinese Medicine, Guizhou University for Nationalities, Guiyang Guizhou

Received: Jun. 18^th, 2022; accepted: Jul. 15^th, 2022; published: Jul. 22^nd, 2022

ABSTRACT

Objective: To establish a UPLC fingerprint analysis method for Yiqing granules of different batches from different manufacturers, compare the differences in fingerprints between different manufacturers, and provide a strong basis for effective control and quality evaluation of Yiqing granules produced by different manufacturers. Methods: ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) column was used with acetonitrile (A)-0.1% formic acid aqueous solution (B) as mobile phase. The detection wavelength was set at 254 nm. The flow rate was 0.1 mL/min. The column temperature is 30˚C. The injection volume was 1 μL. The fingerprints of 24 batches of Yiqing granules from different manufacturers were determined, and the similarity comparison, cluster analysis and principal component analysis of Yiqing granules from different manufacturers were carried out. At the same time, some chemical constituents in Yiqing granules were identified. Results: The similarity of the UPLC fingerprint of 24 batches of samples was between 0.674 and 0.978. There were differences in the composition of Yiqing granules from different manufacturers. The quality of Yiqing granules from the same manufacturer was stable. Systematic cluster analysis divided 24 batches of Yiqing granules into three categories, and the same manufacturers were clustered into one category. The VIP value was used to screen out six differential peaks leading to differences. At the same time, ten chemical components were identified, including emodin, rhein, chrysophanol, aloe-emodin, emodin methyl ether, baicalin, baicalein, wogonin, berberine hydrochloride, palmatine, etc. Conclusion: The method is simple, reliable, reproducible and stable, which is suitable for the quality control of Yiqing granules from different manufacturers.

Keywords:Yiqing Granules, UPLC Fingerprint, Quality Evaluation

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 前言

一清颗粒由黄连、大黄和黄芩三味中药提取制成的复方颗粒制剂，收载于《中国药典》2020版一部；具有清热泻火解毒，化瘀凉血止血之功效，临床上主要用于治疗火毒血热所致的身热烦躁、目赤口疮、咽喉牙龈肿痛、大便秘结、痔血、咽炎、牙龈炎等症 [1] 。

配方颗粒的品质可能会受到原药材的品质、来源、采收期等影响，而生产一清颗粒的厂家众多，在制备上虽有固定的工艺，但不同厂家间获取原药材的渠道不一。容易造成对一清颗粒的质量参差不齐。而目前关于一清颗粒质量控制方面的研究主要集中在对其部分成分如：黄芩苷、小檗碱等成分的含量测定方面 [2] [3] ，然而仅通过单一学或某两个化成分无法全面反映不同厂家一清颗粒的整体质量和疗效。且各指标间存在一定相关性和独立性,难以真正控制其质量。因此，有必要对不同厂家生产的一清颗粒进行质量控制。中药指纹图谱因其整体性、综合性和模糊性的特点，为复杂中药及其制剂的多指标质量控制提供了新的思路和方法 [4] [5] 。现虽有关于一清颗粒HPLC指纹图谱的相关报道 [6] ，但未见不同厂家不同批次一清颗粒指纹图谱和单味药材成分归属研究方面的文献报道，未能阐明不同厂家一清颗粒的质量差异问题。且UPLC与传统的HPLC相比，具有分离度高、速度快、灵敏度高等优点。因此，本文采用UPLC-PDA色谱分析技术，建立五个厂家24批一清颗粒指纹图谱，结合相似度评价、系统聚类分析和主成分分析，寻找各自之间的差异性，以期探讨不同厂家一清颗粒质量的差异，为一清颗粒的质量评价及深入研究提供参考依据。

2. 仪器、材料与试剂

2.1. 仪器

ACQUITY UPLC超高效液相色谱，配备光电二极管矩阵(PDA)检测器 (美国，Waters)；超声波清洗机(型号：HS-10260T，天津市恒奥科技发展有限公司)；数显恒温水浴锅(型号：HH-6，常州澳华仪器有限公司)；《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件(2004A版) (国家药典委员会)。

2.2. 材料

一清颗粒：规格为每袋7.5 g，来源见表1。对照品大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、巴马汀均来源于成都瑞芬思生物科技有限公司，含量均>97%。

表1. 一清颗粒来源与批号

2.3. 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

3. 方法与结果

3.1. 色谱条件

色谱条件：色谱柱为ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%的甲酸水溶液(B)以(0~3 min, 8.5% A~18% A; 3~18 min, 18% A~31% A; 18~24 min, 31% A~45% A; 24~32 min, 45% A~45.5% A; 32~40 min, 45.5% A~80% A; 40~45 min, 80%; 45~50 min, 80% A~8.5% A)进行梯度洗脱；检测波长为254 nm；流速为0.1 ml/min；柱温为30℃；进样量为1 μl。

3.2. 对照品溶液的制备

对照品溶液制备：精密称取大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、巴马汀对照品各0.5 mg，加甲醇定容至10 ml，使之溶解后，滤过(0.22 μm微孔滤膜)，备用。

混合对照品溶液：取上述对照品溶液母液各1 ml，加甲醇定容至10 ml混匀，滤过(0.22 μm微孔滤膜)，备用。

3.3. 供试品溶液的制备

取一清颗粒1.0 g，精密称定，置50 ml的锥形瓶中，加甲醇25 ml，超声处理两次(每次加25 ml甲醇各超声30 min)，过滤，合并滤液，于水浴锅上蒸干，用甲醇溶解定容至10 ml，摇匀，滤过(0.22 μm微孔滤膜)，备用。

3.4. 方法学考察

3.4.1. 精密度试验

精密称取S3批号一清颗粒样品1.0 g，按“2.3”项下制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测试，连续进样6针，记录色谱图，六个图谱的相似度分别为1.000，1.000，1.000，1.000，1.000，1.000，并记录各共有峰的保留时间和峰面积，以黄芩苷为参比峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD < 3%，表明仪器精密度良好。

3.4.2. 重复性试验

精密称取S3批号一清颗粒6份1.0 g，按“2.3”项下制备方法制备供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进行测试，记录色谱图，六个图谱的相似度分别为0.999，1.000，1.000，1.000，1.000，1.000，并记录各共有峰的保留时间和峰面积，以黄芩苷为参比峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD < 3%，表明方法重复性良好。

3.4.3. 稳定性试验

精密称取S3批号一清颗粒样品1.0 g，按“2.3”项下制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测试，分别在0 h，3 h，6 h，9 h，12 h，24 h进样，记录色谱图，计算出六个图谱的相似度分别为0.996，0.998，0.998，0.998，0.996，0.996，并记录各共有峰的保留时间和峰面积，以黄芩苷为参比峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD < 3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

4. 指纹图谱的建立及分析

不同厂家一清颗粒指纹图谱建立及相似度评价

取5个不同厂家的一清颗粒共24批次，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下条件进行指纹图谱测定，将24批次样品指纹图谱的AIA数据文件导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行分析，以S1作为参照图谱，五个厂家24批一清颗粒指纹图谱的共有峰仅只有11个，分别为图1所示的1号、2号、6号、20号、28号、31-36号色谱峰，相似度在0.598~0.847之间，24批次一清颗粒色谱图见图2。而各厂家不同批次的指纹图谱相似度及共有峰依次为：E厂家(10个批次)：0.992~0.998、36个共有峰；D厂家(2个批次)：1.00、1.00、共有峰24个；C厂家(4个批次)：0.997~0.998、26个共有峰；B厂家(6个批次) 0.992~0.995、11个共有峰；A厂家(2个不同批次)：0.998、0.998、22个共有峰；以20号峰(黄芩苷)为参照峰，计算各共有峰的相对相对峰面积。结果见表2。

图1. E厂家一清颗粒的UPLC对照指纹图谱R

图2. 不同厂家一清颗粒UPLC指纹图谱(S1~S2为A厂家；S3~S8为B厂家；S9~S12为C厂家；S13~S14为D厂家；S15~S24为E厂家)

表2. 不同厂家一清颗粒指纹图谱共有峰的相对峰面积

5. 对照品指纹图谱的指认

取混合对照品，按“2.2”项下方法制备，吸取1 μm在“2.1”项色谱条件下注入UPLC-PDA联用仪中进行测定。由此混合对照品从左往右依次为黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。将5个厂家指纹图谱与10个对照品进行成分指认，如见图3所示，由图3可知，5个厂家中均含有除大黄素甲醚以外的9个对照品指纹图谱，但各厂家之间的含量存在一定差异，表明各厂家一清颗粒的质量不均一。

图3. 不同厂家一清颗粒与对照品UPLC指纹图谱(S1：混合对照品；S2：E厂家；S3：D厂家；S4：C厂家；S5：B厂家；S5：A厂家)

6. 相对峰面积的聚类分析

将5个不同厂家的一清颗24批样品UPLC图谱中的36个共有峰(没有共有峰数据的以0来计)的相对峰面积值标准化组成24 × 36阶原始数据矩阵，运SPSS 20.0软件进行系统聚类分析，采用组间连接法，利用欧式距离(Euclidean)作为样品的测度。根据24批样品之间相关系数由大到小的顺序合并，样品中S9、S10、S11、S12聚为I类，S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、S22、S23、S24聚为II类，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S13、S14聚为III类。结果见图4。

7. 主成分分析(PCA)

为了合理评价、综合分析不同厂家一清颗粒化学成分的差异性，对24批一清颗粒的相对峰面积进行主成分分析。将所有一清颗粒样品共有峰的相对峰面积导入SIMCA14.0软件中，得到3大特征主成分PC1，PC2，PC3，结果见图5。从所得的方差贡献率来看，建立的模型累计解释能力参数R2X、预测能力参数Q2分别为0.868，0.714，说明该模型的区分程度和预测程度较好，所以前3个主成分分析已基本能反映出一清颗粒的主要特征。

以主成分建立坐标系，得到24批一清颗粒样品的PCA得分图、载荷图，由PCA得分图可知，24批一清颗粒样品可聚为3大类：S15~S24聚为一类，S9~S12为一类，S1~S8、S13、S14、S聚为一类，与聚类分析结果一致。载荷图上每个点代表一个变量，离原点距离越远，表明该成分含量变化对分类的贡献越大，表明不同厂家的一清颗粒之间有一定的区分，说明不同厂家一清颗粒在化学成分的种类和量

图4. 24批一清颗粒样品指纹图谱的聚类分析

图5. 24批一清颗粒样品共有峰相对峰面积第1，2，3主成分的方差累计贡献率

上具有一定的差异性，见图6和图7。为更好地反映24批一清颗粒的成分差异，基于PCA结果，采用正交偏最小二乘法–判别分析(OPLS~DA)，根据模型的VIP值来筛选导致差异性的主要化学成分，结果见图8。一般认为VIP > 1的变量对分类起着关键作用，从图7可知：30号峰、17号峰、19号峰、22号峰、24号峰、16号峰、36号峰、10号峰、18号峰、8号峰、21号峰、15号峰、14号峰、4号峰、27号峰、3号峰、32号峰、28号峰的VIP均大于1，而导致一清颗粒最大差异的是30号峰、17号峰、19号峰、22号峰、24号峰、16号峰。因此，不同厂家一清颗粒在其化学成分的种类和量具有明显的区分。

图6. 24批一清颗粒样品共有峰相对峰面积的主成分PCA得分图

图7. 24批一清颗粒样品共有峰相对峰面积的主成分PCA载荷图

图8. 24批一清颗粒样品共有峰相对峰面积PLS-DA模型差异性标志物的VIP值图

8. 结果与讨论

本文通过液相指纹图谱技术建立了多个厂家一清颗粒UPLC指纹图谱分析方法，其相似度在0.598~0.847之间。而A、B、C、D、E厂家各自之间一清颗粒UPLC指纹图谱相似度高，在0.992~1.000之间，且在不同厂家间样品的共有峰个数上有差异；对照品指认发现5个厂家中均含有除大黄素甲醚以外的9个对照品指纹图谱，但各厂家之间的含量存在一定差异；系统聚类分析将24批一清颗粒分为3大类5小类，且按厂家呈现一定的规律性，同一厂家聚为一小类。主成分分析其分为三个主成分，结合样品间各峰的峰面积大小分析发现三个主成分一清颗粒间色谱峰所对应的化学成分含量与种类存在较大差异，而导致不同厂家一清颗粒差异大的主要成分为30号峰、17号峰、19号峰、22号峰、24号峰、16号峰。

以上结果可知，同一厂家一清颗粒样品之间指纹图谱相似度差异较小，表明同一厂家生产制备的一清颗粒的质量及其化学成分较稳定；不同厂家一清颗粒指纹图谱差异较大；不同厂家可能因其生产过程中所采购的药材来源(品种、产地、采收期、加工炮制、药用部位等)、制备工艺的控制、储藏条件等不同而导致其制剂的质量差异及某些化学成分的增减或改变。质量差异是导致疗效和副作用的关键因素，可能会在临床用药上带来较大的安全隐患。建议各厂家严把药材质量关口，统一生产工艺，并建立合理的质控指标。液相指纹图谱技术不仅可以识别不同厂家一清颗粒的异同性，也可为不同厂家一清颗粒所用的原药材来源的识别提供参考。该研究为一清颗粒的整体质量控制提供了参考。

基金项目

贵州省一流课程重点建设项目(项目合同编号：黔教高发[2017]158)。

文章引用

曾 倩,黄旭龙,王祥培,吴红梅. 不同厂家一清颗粒UPLC指纹图谱的比较
Study on UPLC Fingerprint of Yiqing Granules from Different Manufacturers[J]. 药物资讯, 2022, 11(04): 309-320. https://doi.org/10.12677/PI.2022.114040

参考文献