ABSTRACT

Using Canna edulis Ker starch as raw material, the ratio of material to water was 1:3, and the degradation of Canna edulis Ker starch was studied by the pullulanase-assisted double enzyme method. It was determined by experiments that the optimum stage of the addition of pullulanase was added before liquefaction. Compared with the control group, the addition of pullulanase 30 µ/g before liquefaction can increase the content of reducing sugar by 1.29%, and the alcohol content after fermentation was increased by 1.3. The results indicated that the addition of pullulanase was helpful for the double enzymatic degradation of Canna edulis Ker starch.

Keywords:Pullulanase, Double Enzymatic Method, Canna edulis Ker Starch, Degradation

普鲁兰酶辅助双酶法降解芭蕉芋淀粉的研究

王昌梅¹，张无敌^1*，韩伟^1,2，黄文荣^1,2*，雷宇^1,2，李万仙^1,2，尹芳¹，赵兴玲¹，杨 斌¹，吴 凯¹，柳 静¹，杨 红¹，刘士清¹

¹云南师范大学太阳能研究所，云南 昆明

²云南万芳生物技术有限公司，云南 昆明

收稿日期：2019年10月29日；录用日期：2019年11月12日；发布日期：2019年11月19日

摘 要

以芭蕉芋淀粉为原料，料水比为1:3进行发酵，确定了普鲁兰酶辅助双酶法对芭蕉芋淀粉的降解情况。通过实验确定普鲁兰酶添加的最适阶段是在液化前添加，与对照组相比，在液化前先添加普鲁兰酶30 µ/g，可使还原糖的含量提高1.29%，发酵结束后的酒精质量分数提高1.3，结果表明添加普鲁兰酶有助于双酶法降解芭蕉芋淀粉。

关键词 :普鲁兰酶，双酶法，芭蕉芋淀粉，降解

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1. 引言

芭蕉芋，学名蕉藕，是美人蕉科美人蕉属多年生单子叶草本植物，原产于南美等地，我国主要分布在贵州、云南、广西、广州等南部省区 [1] [2] [3] [4]，具有适应性广、喜温光、抗逆性强、产量高、易栽培、用途广等特点。芭蕉芋块茎含有高达60%的淀粉，近年来已有将芭蕉芋淀粉简单物化改性制备改性淀粉 [5]、生产粉丝、淀粉糖、代餐粉和甘油等产品 [4] [6] [7] [8]，也有将芭蕉芋淀粉经生物转化而获得乙醇 [9] [10]。普鲁兰酶是淀粉酶的一种，属于脱支类淀粉酶，用普鲁兰酶对淀粉适度处理能改变淀粉的分子结构和理化特性 [11] [12]。普鲁兰酶与双酶法结合应用到原料水解工艺中，可提高淀粉转化还原糖的效率，增加发酵速度，提高原料利用率 [13]。

来源于不同产地的同一品种，原料的成分也有所不同，成分不同会影响原料的出酒率，通过对其所含的水分、淀粉含量、蛋白质含量、脂肪、纤维素含量进行常规分析后，有针对性添加酶制剂，可有效促进原料的充分降解及利用。根据芭蕉芋淀粉的特性，本文在糖化、液化的不同阶段添加普鲁兰酶，并与α-淀粉酶及糖化酶相结合，对芭蕉芋淀粉的降解情况进行试验研究，以期为芭蕉芋淀粉制备燃料乙醇提供基础数据。

2. 材料与方法

2.1. 主要原材料

α-淀粉酶：上海晶抗生物工程有限公司，10,000单位

糖化酶：南宁庞博生物工程有限公司，20,000单位

普鲁兰酶：上海鼎好生物科技有限公司，2000单位

酿酒高活性干酵母：山东伟多丰生物技术有限公司

芭蕉芋淀粉：购于昭通市农贸市场。

2.2. 仪器设备

分析天平、台式高速离心机、分光光度计、可控温电炉、恒温水浴锅、酸度计、容量瓶、三角瓶、滴定、电热鼓风干燥箱等。

2.3. 测定项目及方法

还原糖、总糖检测：采用菲林试剂直接滴定法 [14] [15] 测定糖化前后和发酵后10 mL料液中还原糖和总糖含量。根据还原糖含量推算淀粉含量 [16]。

低聚糖的测定：采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法 [17]。

粗蛋白含量：采用海能全自动凯氏定氮仪测定芭蕉芋淀粉中蛋白质含量 [18]。

粗脂肪含量：利用索氏抽提法测定 [19]。

水分、灰分含量：采用常规测定方法 [10] 测定。

pH：采用pH计直接测定法测量糖化后和发酵后的料液pH值。

酒精体积分数的测定：取100 mL芭蕉芋发酵料，置于500 mL圆底烧瓶中，加100 mL水进行蒸馏，用100 mL容量瓶收集馏出液体，并定容至100 mL，采用比重瓶法测定酒精体积分数 [20]。

2.4. 试验方法

2.4.1. 不同阶段添加普鲁兰酶的作用效果

首先通过预实验确定了淀粉酶和糖化酶适合用量分别为5 µ/g及150 µ/g芭蕉芋淀粉。在此基础上共设4个处理方式，即在不同阶段按普鲁兰酶30 µ/g芭蕉芋淀粉添加：A组在淀粉酶液化前首先加入；B组与淀粉酶同时加入；C组与糖化酶同时加入；以不加入普鲁兰酶为对照(CK)。具体试验方法为：A组将芭蕉芋淀粉与水按1:3的量调成淀粉糊，在搅拌下水浴加热至90℃糊化，冷却至60℃时加入普鲁兰酶(30 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min ；再将温度升高至70℃，加入α-淀粉酶(5 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；最后将温度降低至60℃，加入糖化酶(150 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min。B组将木薯淀粉与水按1:3的量调成淀粉糊，在搅拌下水浴加热至90℃糊化，再降低到70℃时加入淀粉酶(5 µ/g芭蕉芋淀粉)和普鲁兰酶(30 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；再将温度降低至60℃，加入糖化酶(150 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min。C组将芭蕉芋淀粉与水按1:3的量调成淀粉糊，在搅拌下水浴加热至90℃糊化，再降低到70℃时加入淀粉酶(5 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；再将温度降低至60℃，同时加入糖化酶(150 µ/g芭蕉芋淀粉)和普鲁兰酶(30 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min。D组为CK组不添加普鲁兰酶。各阶段结束后取样测定还原糖和总糖含量。

2.4.2. 添加不同剂量普鲁兰酶的降解效果

通过不同阶段添加普鲁兰酶的作用效果，确定了在液化前添加普鲁兰酶对芭蕉芋淀粉的降解效果更好。在500 ml三角瓶中，将芭蕉芋淀粉与水按1:3的量调成淀粉糊，在搅拌下水浴加热至90℃糊化，冷却至60℃时加入普鲁兰酶(设定添加的普鲁兰酶量分别为0 µ/g，5 µ/g，10 µ/g，15 µ/g，20 µ/g，25 µ/g，30 µ/g，35 µ/g和40 µ/g)，保持30 min；再将温度升高至70℃，加入α-淀粉酶(5 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；最后将温度降低至60℃，加入糖化酶(150 µ/g芭蕉芋淀粉)，保持30 min；冷却至32℃左右，按0.5‰添加安琪酵母，按2‰添加尿素和磷酸二氢钾并拌匀 [21]，瓶口塞上发酵栓，于32℃恒温箱中进行酒精发酵60 h。发酵结束检测还原糖含量，总糖含量以及酒精质量分数。

3. 结果与分析

3.1. 原料基本特性测定结果

以购买于农贸市场的芭蕉芋淀粉为原料，经测定其基本成分如表1所示。

表1. 芭蕉芋淀粉的成分

由表1可以看出，实验所用原料中的粗淀粉含量较高，达60%以上。同时还含有蛋白、纤维和脂肪等，其中脂肪含量较低，仅占0.35%。据文献报道 [5]，芭蕉芋淀粉的磷和结合磷含量接近于马铃薯淀粉，比玉米淀粉略高。

3.2. 不同阶段添加普鲁兰酶对糖含量的影响

以芭蕉芋淀粉为原料发酵制备乙醇的过程中，不同的处理阶段添加普鲁兰酶30 µ/g，即分别在淀粉酶液化前加入(A组)、与淀粉酶同时加入(B组)以及与糖化酶同时加入(C组)，对照组不添加普鲁兰酶，各阶段结束后分别测定体系中的还原糖和总糖含量，结果如表2、表3所示。

表2. 不同阶段添加普鲁兰酶处理芭蕉芋淀粉后还原糖含量(%)

从表2可以看出，在芭蕉芋淀粉降解工艺中添加普鲁兰酶后，体系中还原糖含量均高于对照组，其中A处理(液化前添加普鲁兰酶)的还原糖含量增加较明显，糖化后还原糖含量比对照组提高了1.45%。这说明在液化前添加普鲁兰酶，对芭蕉芋淀粉进行预处理，更有助于后续糖化酶对淀粉的降解。

表3. 不同阶段添加普鲁兰酶处理芭蕉芋淀粉后体系中总糖含量(%)

从表3可以看出，在芭蕉芋淀粉降解工艺中添加普鲁兰酶后，总糖含量有明显提高，在前两阶段C处理组中的总糖含量最高，B处理组次之，经过糖化阶段后，B处理组中总糖含量最高，C处理组次之。可以看出，普鲁兰酶的添加能提高体系中总糖的含量，但添加顺序对体系中总糖含量变化的影响并不明显。

从表2和表3可以看出，添加普鲁兰酶后，体系中还原糖和总糖含量都有不同程度的提高，其添加的顺序对体系还原糖含量有很大的影响，而对总糖含量影响并不明显。从经济性和实用性的角度考虑，B处理比较合理，即在液化阶段，添加普鲁兰酶对芭蕉芋淀粉进行降解的效果最好。

3.3. 普鲁兰酶添加量对芭蕉芋淀粉糖化及酒精体积分数的影响

为了进一步确定普鲁兰酶对芭蕉芋淀粉降解效果的影响，采取在液化阶段同时添加不同用量的普鲁兰酶(0 µ/g、5 µ/g、10 µ/g、15 µ/g、20 µ/g、25 µ/g、30 µ/g、35 µ/g和40 µ/g)，再糖化并继续发酵产乙醇，结束后对体系中还原糖、总糖含量以及酒精质量分数进行了测定，结果见表4。

表4. 普鲁兰酶添加量对体系还原糖、总糖和酒精质量分数的影响

从表4中可以看出，随着普鲁兰酶用量的增加，体系中还原糖含量也在增加，普鲁兰酶用量在0 µ/g至10 µ/g，体系中还原糖含量缓慢增加；当用量在10 µ/g至20 µ/g，体系中还原糖含量增幅最为明显；当用量20 µ/g至30 µ/g，体系中还原糖含量缓慢增加，并在此范围内达到还原糖含量达到了最大值；超过30 µ/g时，体系中还原糖含量降低。普鲁兰酶的添加，对体系中总糖的影响趋势与对还原糖的类似，但没有对还原糖的影响明显。普鲁兰酶的添加，对酒精质量分数的影响较明显，与不添加普鲁兰酶发酵的结果相比，提高了1.3。因此，考虑成本问题，普鲁兰酶最适用量20 µ/g至30 µ/g之间。

4. 结论

1) 在液化前添加普鲁兰酶有助于芭蕉芋淀粉的降解。

2) 添加普鲁兰酶的量过少，达不到理想效果，糖化率偏低，若普鲁兰酶添加过多，将会增加成本。本实验条件下，普鲁兰酶的最适用量为30 µ/g芭蕉芋淀粉，可使还原糖的含量达到10.31%，比对照组提高1.29%，发酵结束后的酒精质量分数提高了1.3。

3) 普鲁兰酶辅助双酶法可有效提高芭蕉芋淀粉的降解率。

基金项目

云南省国际科技特派员项目(2015IA022)；云南省农村能源工程重点实验室基金项目(2017KF03)；云南省科技富民强县计划(2014EA006)和昆明市科技计划项目(2014-01-A-G-02-3059)联合资助。

文章引用

王昌梅,张无敌,韩 伟,黄文荣,雷 宇,李万仙,尹 芳,赵兴玲,杨 斌,吴 凯,柳 静,杨 红,刘士清. 普鲁兰酶辅助双酶法降解芭蕉芋淀粉的研究
Study on Degradation of Canna Edulis Starch by the Pullulanase-Assisted Double Enzyme Method[J]. 食品与营养科学, 2019, 08(04): 285-290. https://doi.org/10.12677/HJFNS.2019.84037

参考文献