ABSTRACT

Objective: To investigate the effect and mechanism of Berberine on inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis in Hepatocellular carcinoma Hep-G2 cell line. Methods: The inhibitory effect of Berberine on the proliferation of Hep-G2 cells was detected by CCK-8 method; effect of Berberine on cell apoptosis by flow cytometry (FCM); western blotting and real time fluorescent quantitative PCR (RT-PCR) analysis were used to detect the mRNA and protein expression of anti proliferation gene BTG2 and CyclinB1, cyclin D1. Results: The proliferation of Hep-G2 cell lines was inhibited by Berberine in a dose and time dependent manner, and compared with the control group, the difference was statistically significant (p < 0.01). Berberine promotes cell apoptosis, and the rate of apoptosis is proportional to the effect time of Berberine (P < 0.01). The expression of BTG2 mRNA increased with the time of Berberine treatment (p < 0.01), and compared with the control group, there’s significant difference (p < 0.01); while the expression of CyclinB1, CyclinD1 mRNA was gradually decreased with the time of Berberine intervention (p < 0.01 or p < 0.05), and the difference was significantly compared with the control group (p < 0.01). Compared with the control group, the differential expression of BTG2 and CyclinB1, CyclinD1 protein was significant (p < 0.05). Conclusions: Berberine can inhibit the proliferation of Hep-G2 cells and induce cells apoptosis, which mechanism may be related to the up-regulation of BTG2 and down-regulation of CyclinB1, Cyclin D1 by berberine.

Keywords:Berberine, Hepatocellular Carcinoma, Cell Proliferation, Cell Apoptosis, BTG2, CyclinB1, Cyclin D1

黄连素对肝癌Hep-G2细胞株的作用研究

王敏¹，张志敏²，章必成²，杨波²，刘兰²，付红星²，饶智国²

¹湖北中医药大学2015级研究生班，湖北 武汉

²解放军武汉总医院肿瘤科，湖北 武汉

收稿日期：2018年3月6日；录用日期：2018年3月18日；发布日期：2018年3月26日

摘 要

目的：探讨黄连素(berberine, BBR)作用于肝癌Hep-G2细胞增殖和凋亡的机制。方法：CCK-8法检测BBR对Hep-G2细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测BBR对细胞凋亡的影响；蛋白印迹法(Western blotting)及实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测抗增殖基因BTG2及细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1的蛋白及mRNA表达的情况。结果：与对照组相比，BBR可以抑制肝癌Hep-G2细胞的增殖，且抑制率与BBR浓度成正比，差异具有统计学意义(p < 0.01)；与对照组相比，BBR可诱导细胞凋亡(p < 0.01)，且凋亡率随着黄连素的作用时间的延长而增加(p < 0.01)；BTG2 mRNA的表达随着BBR作用时间的延长逐渐增强(p < 0.01)，且与对照组相比，差异具有显著性(p < 0.01)，而CyclinB1、CyclinD1mRNA的表达则随着BBR作用时间的延长逐渐减弱(p < 0.01或p < 0.05)，与对照组相比，差异具有显著性(P < 0.01)；与对照组相比，BTG2和CyclinB1、CyclinD1蛋白表达的差异具有显著性(p < 0.05)。结论：BBR可抑制肝癌细胞Hep-G2的增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与其上调抗增殖基因BTG2和下调细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1的表达有关。

关键词 :黄连素，肝癌，细胞增殖，细胞凋亡，BTG2，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1

Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占90%以上，最新资料显示HCC高居中国肿瘤发病的第3、4位和肿瘤死因的第2、3位 [1] [2] 。对于原发性肝癌的治疗，最根本的方法是手术切除，但由于起病隐袭、侵袭性高、进展迅速和早期诊断困难，我国HCC患者确诊时多己为局部晚期或者发生远处转移，往往不适合或不能够单独采取外科手术、肝动脉栓塞化疗(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)或理化消融等局部治疗 [3] 。这类患者预后很差。

黄连素又称小檗碱，1959年Hano [4] 报道了其具有抗肿瘤活性。近年研究发现黄连素及其衍生物可选择性诱导人肝癌细胞死亡，但对人的正常肝细胞无细胞毒性，表明黄连素及其衍生物具有肝癌靶向细胞毒性，有可能成为有前途的多功能抗肝癌药物 [5] 。本文以体外细胞实验研究黄连素调节抑癌基因BTG2和细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1的表达来探讨其抗肝癌细胞株Hep-G2作用机制及可能影响的信号通路的研究，且该方面的研究及报道较少见，为其临床应用于肝癌的治疗提供理论基础，也为后期更为精确的用药提供理论支持。

2. 材料与方法

2.1. 药品和试剂

黄连素(盐酸小檗碱)购自成都艾特姆生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；PI染色试剂盒及AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒均购自Bio-Swamp公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，鼠抗BTG2和兔抗CyclinB1、CyclinD1抗体均购自Abcam公司；引物由上海Invitrogen生物制品公司合成；Trizol购自北京康为世纪生物科技有限公司，SYBR Green PCR试剂盒购自KAPA Biosystems公司，逆转录试剂盒购自TAKARA公司。

2.2. 细胞系与细胞培养

人肝癌细胞株Hep-G2由中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)提供，用MEM Hyclone培养基、10%胎牛血清、青霉素-链霉素溶液配制成的完全培养基，于37℃、5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时备用。

2.3. CCK-8检测BBR对Hep-G2细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的Hep-G2细胞，接种于三个96孔板中，100 ul/孔，于37℃、5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，给予不同浓度的BBR (12.5，25，50，100，200 µmol/L)干预细胞，另设阴性对照组(只有细胞和培养基)和空白组(没有细胞只有培养基)，每个浓度设五个复孔，每个96孔板边缘孔均加入PBS 100 ul，分别培养24 h、48 h、72 h后，吸出原液，用遇冷的PBS洗涤一遍，每孔加入用MEM培养基稀释的CCK-8 100 ul，置于细胞培养箱中孵育三小时。用酶联免疫检测仪测定每孔在450 nm处的吸光度值，然后根据公式计算细胞增殖抑制率。实验重复三次。细胞增殖抑制率(%) = [1 − (实验组OD值 − 空白组OD值)/(阴性对照组OD值 − 空白组OD值)] × 100%。经加权直线回归方程计算出黄连素抑制细胞增殖率为25%时的对应浓度值。

2.4. 流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡率

取对数生长期的细胞，制成3 × 10⁵/ml的单细胞悬液，接种于三个6孔板中，于37℃、5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，给予抑制率为25%的BBR用药浓度对细胞进行处理，另设空白对照组，继续孵育24、48、72小时。孵育时间到后用遇冷的PBS洗涤两遍，胰酶消化，离心收集细胞，并重悬于200 ul的Binging Buffer中，再根据PI染色试剂盒和AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书进行细胞染色，最后用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡细胞分布情况。实验重复三次。

2.5. Western Blot检测BTG2和CyclinB1、CyclinD1的蛋白表达情况

取对数生长期的细胞，制成3 × 10⁵/ml的单细胞悬液，接种于三个6孔板中，于37℃、5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，给予抑制率为25%的BBR用药浓度对细胞进行处理，另设空白对照组，继续孵育24、48、72小时。收集细胞后提取蛋白并根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定各组蛋白的含量，每组样品各取40 µg蛋白进行上样。根据10% SDS-PAGE凝胶试剂盒制成分离胶和5%的浓缩胶，进一步电泳、转膜，将凝胶上的蛋白转移至NC膜上。用5%的BSA室温下于摇床上封闭1小时，加入一抗(鼠抗BTG2和兔抗CyclinB1、CyclinD1，工作液的浓度分别为1:500、1:1000和1:1000)，于4℃冰箱里孵育过夜，1 × TBST洗涤液洗膜后再加入相应的二抗((1:5000 HRP 标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG),室温下于摇床上孵育30 min，以β-actin作为内参。仍然用1 × TBST洗涤液洗膜后，用ECL化学发光法进行观察。实验重复三次。

2.6. RT-PCR检测BTG2和CyclinB1、CyclinD1 mRNA的表达

取对数生长期的细胞，制成3 × 10⁵/ml的单细胞悬液，接种于三个6孔板中，于37℃、5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，给予抑制率为25%的BBR用药浓度对细胞进行处理，另设空白对照组，继续孵育24、48、72小时。孵育时间到后收集各组细胞，提取蛋白后用Trizol提取总RNA，并测定RNA的质量，根据逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA，根据该试剂盒的说明书，反转录的条件是：20 uL反应体系，其反应程序是42℃，60 min；70℃，10 min；−20℃，hold。根据PCR试剂盒说明书及荧光定量PCR仪对cDNA进行扩增，反应体系20 uL：PreMix 10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 模板1 μL及ddH₂O 8 μL，PCR扩增反应程序设置：94℃预变性1 min；94℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，循环40次；72终末延伸5 min；4℃保温。最后运用c-omparative2^−△△CT 法分析各基因的相对表达。实验重复三次。所用引物序列见表1。

2.7. 统计学处理

应用SPSS 20.0软件进行实验数据的统计学分析，实验数据均以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，若方差不齐则采用Tamhane检验，以p < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. BBR对肝癌Hep-G2细胞增殖的影响：见表2

各组BBR作用于HepG-2细胞12 h、24 h、48 h、72 h后，细胞生长出现明显抑制，且细胞生长抑制率随药物浓度的增加而升高。经加权直线回归方程计算出BBR作用于HepG-2细胞24 h的抑制率为25%的BBR用药浓度为30 µmol/L。

3.2. BBR对Hep-G2细胞凋亡的影响：见图1，表3

将浓度为30 µmol/L的BBR干预Hep-G2细胞24 h、48 h、72 h小时后，与对照组相比，实验组细胞凋亡率增加，具有明显的时间依耐性，差异具有显著性(P < 0.01)。

3.3. BBR对Hep-G2细胞BTG2 mRNA和CyclinB1、CyclinD1mRNA表达的影响：见图2

将浓度为30 µmol/L的BBR分别干预细胞24 h、48 h、72 h后，与对照组相比，BTG2 mRNA的相对表达量逐渐增加(P < 0.01)，随着作用时间的延长增加更显著(P < 0.01)。而CyclinB1、CyclinD1mRNA的表达，与对照组相比，逐渐减低(P < 0.01)。

3.4. BBR对Hep-G2细胞BTG2和CyclinB1、CyclinD1蛋白表达的影响：见图3

与对照组相比，将浓度为30 µmol/L的BBR分别干预细胞24 h、48 h、72 h后，BTG2蛋白的表达逐渐增高(P < 0.01)。同时CyclinB1、CyclinD1蛋白的表达逐渐减弱(P < 0.01或P < 0.05)。

4. 讨论

黄连素，可从传统中药黄连、黄柏、三颗针等植物中提取，黄连素及其衍生物在治疗心血管疾病、抗肿瘤、免疫调节、精神疾病、骨质疏松等多方面具有一定的药理作用。近年研究显示黄连素可通过诱导ROS生成 [6] 、调节HIF-1α、抑癌因子p21WAFl/CIPl、细胞周期蛋白CyclinB1的表达 [7] [8] 、触发Caspase-3、Caspase-8和Caspase-7的活性 [9] 、抑制NF-κB的活性及其通路影响VEGF mRNA和蛋白的表达 [10] 、提高GRP78/HSPA5的表达 [11] 等多种途径影响肿瘤细胞的增殖、调控细胞周期、抑制侵袭及转移、调节自噬、增敏增效等方面发挥其抗肿瘤作用。

BTG2 (B-cell translocation gene-2)作为一种抗增殖基因，是早期瞬时反应基因之一，属于BTG/Tob抑癌基因家族成员之一。已有大量研究证实，BTG2在许多肿瘤中的表达下调，在多种肿瘤细胞的分化、

表1. 本研究使用的实时荧光定量PCR引物序列

表2. 不同浓度的BBR培养HepG2不同时间后细胞生长抑制率的比较(%，)

注：BBR为黄连素；Hep-G2为人肝癌细胞株；每组每个时间点的样本量为3；^a代表与空白对照组的比较P < 0.01；^b代表与12.5 μmol/L的比较P < 0.01；^c代表与25 μmol/L的比较P < 0.01；^d与50 μmol/L的比较P < 0.01；^e与100 μmol/L的比较P < 0.01。

图1. 流氏细胞仪测BBR对Hep-G2细胞凋亡的影响

表3. 一定浓度的BBR培养Hep-G2不同时间后细胞凋亡率的比较(%，)

注：BBR为黄连素；Hep-G2为人肝癌细胞株；^a代表与对照组相比P < 0.01；^b代表实验组之间与24 h的比较P < 0.01；^c代表实验组之间与48 h的比较P < 0.01。

图2. BBR对Hep-G2细胞BTG2和CyclinB1、CyclinD1mRNA表达的影响

图3. BBR对Hep-G2细胞BTG2和CyclinB1、CyclinD1蛋白表达的影响

增殖、DNA损伤修复以及凋亡中起重要作用 [12] [13] [14] [15] [16] ，且与肿瘤的大小、分级、转移、复发及预后不良都有一定关系 [17] 。多个实验研究表明上调BTG2的表达，可抑制乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤等肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡 [18] [19] [20] [21] 。目前，也有学者证实BTG2在肝癌组织中不表达或者表达非常低，而相应的癌旁组织或正常肝细胞中表达则较高，提示BTG2的高表达对肝癌的发生、进展均具有抑制作用 [22] [23] 。本实验结果发现一定剂量的黄连素干预Hep-G2细胞后，BTG2蛋白及mRNA的表达都随着时间延长逐渐增强，差异具有统计学意义。

细胞周期蛋白Cyclin B1作为Cyclins家族的一员，活化并与CDKs即CDC2 (cell division cycle)形成复合物，促使细胞进行G2/M期转变。有多项研究表明，Cyclin B1的表达，在肿瘤细胞的增殖中起重要作用 [24] [25] 。有研究 [26] 发现人肝癌组织中CyclinB1 mRNA表达水平与临床分期、门静脉癌栓、术后复发、肿瘤直径和肿瘤低分化等成正相关。在本实验中当一定剂量的黄连素干预HepG-2细胞后，CyclinB1 mRNA和蛋白的表达均随着时间延长逐渐增强，具有明显时间依赖性，差异具有统计学意义。

Cyclin D1作为一种潜在的原癌基因蛋白，且是调控G1期的关键蛋白，并且在多种肿瘤中过表达。有研究表明下调Cyclin D1的表达，可使细胞周期阻滞在G1期，从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡 [27] [28] 。目前，另有学者研究cyclin D1在丙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织中的表达较癌旁组织，以及基本正常肝脏组织明显增高，且与肝癌组织的病理学分级及患者的不良预后呈正相关，提示cyclin D1高表达的致癌作用 [29] 。在本实验中当一定浓度的黄连素干预HepG-2细胞后，CyclinD1 mRNA和蛋白的表达均随着时间延长逐渐增强，具有明显的时间依耐性，差异具有统计学意义。

肿瘤发生的本质原因是癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活。BTG2作为抗增殖蛋白基因，是细胞周期动力学的重要调节因子，与细胞周期的控制和细胞对DNA损伤反应有关。研究 [8] [28] 发现提高BTG2的表达可抑制CyclinD1蛋白的转录活性，降低CyclinD1蛋白表达，然后通过经视网膜母细胞瘤基因(Rb)途径使细胞阻滞在G1期，促使细胞凋亡。BTG2也可通非Rb途径阻止CyclinB1和Cdc2的结合，抑制Cdc2激酶活性，导致G2期的停滞，而诱导G2/M期的细胞周期阻滞及细胞凋亡。在该实验中我们发现随着一定剂量的黄连素作用时间的延长，细胞的凋亡率逐渐增多，且BTG2蛋白表达逐渐上升，同时CyclinB1、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达逐渐下调，引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。

由此我们推断，黄连素具有抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用。这与前期，我们实验组研究的48 h的半数抑制浓度IC50 = 41.18 μmol/L的黄连素调节肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的结果相一致。其机制之一可能是通过上调抑癌基因BTG2的表达，同时引起CyclinB1、Cyclin D1的表达下调。但是在该实验中黄连素对抗增殖基因BTG2的作用机制并不清楚，有待进一步研究，且BTG2抗肿瘤的作用与Cyclin B1、Cyclin D1的表达抑制是否有直接相关性，也需要进一步实验来证实。若将黄连素用于肝癌的临床治疗，是否具有临床疗效，还需要临床试验及进一步深入探讨。

基金项目

国家自然科学基金青年项目(81301631)。

湖北省卫计委青年人才项目(WJ2017H0036)。

文章引用

王敏,张志敏,章必成,杨 波,刘 兰,付红星,饶智国. 黄连素对肝癌Hep-G2细胞株的作用研究
Effect and Mechanism of Berberine on Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line Hep-G2[J]. 中医学, 2018, 07(02): 158-166. https://doi.org/10.12677/TCM.2018.72026

参考文献