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Hans Journal of Medicinal Chemistry
Vol. 09  No. 02 ( 2021 ), Article ID: 42781 , 9 pages
10.12677/HJMCe.2021.92010

喘可治注射液对人胚胎肺成纤维细胞转化因子及相关蛋白的影响

闫红倩1,2，耿立梅1,2*，于向艳1,2，马蕴蕾1,2

1河北省中医院，河北 石家庄

2河北省中西医结合肺病研究重点实验室，河北 石家庄

收稿日期：2021年4月16日；录用日期：2021年5月21日；发布日期：2021年5月28日

摘要

目的：通过喘可治注射液(CKZ)干预人胚胎肺成纤维细胞(Wi-38)，测定β转化生长因子(TGF-β)、1型胶原纤维蛋白(collagen1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，探讨CKZ在抑制细胞间质转化方面的作用机制。方法：将体外培养的Wi-38细胞随机分为6组：① 对照组，单独的DMEM培养；② 5 ng/mL TGF-β组，加入浓度为5 ng/mL的TGF-β孵育；③ 10 ng/mL TGF-β组，加入浓度为10 ng/mL的TGF-β孵育；④10 ul/mL喘可治注射液(CKZ)组，加入浓度为10 ul/mL CKZ的孵育；⑤ 20 ul/mL CKZ组，加入浓度为20 ul/mL CKZ的孵育；⑥ 10 ng/mL TGF-β + 20 ul/mL CKZ组，同时加入浓度10 ng/mL TGF-β和20 ul/mL CKZ孵育。采用实时荧光定量(qPCR)的方法检测孵育24 h、48 h、72 h的TGF-β、collagen 1、α-SMA的表达水平变化。结果：加入TGF-β处理组细胞的α-SMA、Collagen 1的mRNA水平升高、TGF-β的mRNA水平降低，与对照组相比，其差异均具有统计学意义(P < 0.05)；加入CKZ处理组细胞的α-SMA、TGF-β、Collagen 1的mRNA水平均降低，与对照组相比，其差异具有统计学意义(P < 0.05)；同时加入TGF-β和CKZ处理组细胞的α-SMA、Collagen 1的mRNA水平均显著降低，与TGF-β处理组相比，其差异具有统计学意义(P < 0.05)。结论：TGF-β、collagen 1、α-SMA参与了人胚胎肺成纤维细胞间质转化的病理进程，CKZ对这一进程起到了抑制作用，CKZ具有一定的抑制气道上皮间质转化的作用。

关键词

喘可治注射液，Wi-38，TGF-β，α-SMA，Collagen 1，气道上皮间质转化

Effect of Chuankezhi Injection on Transfer Factors and Related Proteins of Human Embryonic Lung Fibroblasts

Hongqian Yan1,2, Limei Geng1,2*, Xiangyan Yu1,2, Yunlei Ma1,2

1Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang Hebei

2Hebei Key Laboratory of Integrated Chinese and Western Medicine for Lung Disease Research, Shijiazhuang Hebei

Received: Apr. 16th, 2021; accepted: May 21st, 2021; published: May 28th, 2021

ABSTRACT

Objective: To investigate the effect of Chuankezhi injection (CKZ) on human embryonic lung fibroblasts (WI-38), and to explore the mechanism of CKZ in inhibiting the mesenchymal transition by measuring the levels of TGF-β, collagen 1 and α-smooth muscle actin (α-SMA). Method: The cultured Wi-38 cells were randomly divided into 6 groups: ① control group, DMEM incubatedalone; ② 5 ng/mL TGF-β group, incubated with 5 ng/mL TGF-β; ③ 10 ng/mL TGF-β group, incubated with 10 ng/ml TGF-β; ④ 10 ul/mL CKZ group, incubated with 10 ul/mL CKZ; ⑤ 20 ul/mL CKZ group, incubated with 20 ul/mL CKZ; ⑥ 10 ng/mL TGF-β + 20 ul/mL CKZ group, incubated with 10 ng/mL TGF-β and 20 ul/mL CKZ. The expression levels of TGF-β, collagen 1 and α-SMA were detected by qPCR at 24, 48 and 72 h. Result: Compared with the control group, the mRNA levels of α - SMA and collagen 1 were increased and the mRNA levels of TGF-β were decreased in the TGF-β treated group (P < 0.05). The mRNA levels of α-SMA, TGF-β and collagen 1 in CKZ treated cells were all significantly decreased (P < 0.05); Compared with the TGF-β treated group, the mRNA levels of α-SMA and collagen 1 were decreased in the both TGF-β and CKZ treated groups (P < 0.05). Conclusion: TGF-β, collagen 1 and α-SMA participate in the pathological process of mesenchymal transition of human embryonic lung fibroblasts. CKZ may inhibit this process, and CKZ may inhibit airway epithelial mesenchymal transition to some extent.

Keywords:Chuankezhi Injection, Wi-38, α-SMA, TGF-β, Collagen 1, Airway Epithelial Mesenchymal Transition

Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

肺气道上皮间质化转变及气道重塑的主要原因是反复发生的气道慢性炎症及细胞外基质的沉积，它是构成气流受限及阻塞的重要原因 [1]。成纤维细胞作为细胞外基质的主要组成和来源占有十分重要的地位。成纤维细胞能产生胶原纤维、弹性纤维和网状纤维参与气道损伤及修复，还能产生多种细胞因子和炎性介质介导免疫效应 [2] [3]。呼吸系统疾病支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)及肺间质纤维化在气道重塑过程中均伴有不同程度的气道上皮细胞的损伤、修复及间质化转变。喘可治注射液(CKZ)由巴戟天、淫羊藿组成，具有止咳化痰平喘功效，现代研究 [4] [5] 证实能够降低气道炎症因子释放、抗过敏、调节免疫及抗纤维化的作用。为进一步探讨CKZ的疗效机制，本课题组采用CKZ干预人胚胎肺成纤维细胞(Wi-38)，采用实时荧光定量技术研究不同浓度的CKZ对β转化生长因子(TGF-β)、1型胶原纤维(collagen 1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响，探讨CKZ在气道上皮间质化转变进程中的作用，为临床治疗提供一定的依据。

2. 材料

2.1. 细胞及主要试剂

人胚苔肺成纤维细胞Wi-38购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，β转化生长因子(TGF-β，厂家：生工生物)，1型胶原纤维(collagen 1，厂家：生工生物)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，厂家：生工生物)，CKZ (喘可治注射液广州万正药业有限公司国药准字Z20010172)，RNA cDNA第一链合成试剂盒(全式金、AT341)，SG Fast qPCR Master Mix (生工生物，货号B639273)，Ex TaqTM (TAKARA货号DRR100A)。

2.2. 主要器材

实时荧光定量PCR仪(illumina eco 型号eco)，PCR仪(东胜创新生物科技有限公司，型号EDC-810)，紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY02S)，电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表有限公司，型号HW-SY11-K P2)，二氧化碳培养箱(Thermo，型号3111)，生物安全柜(苏净安泰，型号BS-1300IIA2)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS，型号CKX41)，离心机(Thermo，型号MICROCL 17)，电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，型号DHG 9203A)。

3. 方法

3.1. Wi-38细胞培养及分组处理

Wi-38细胞用含10%胎牛血清(FBS)的培养基(DMEM)培养，于37℃ 5% CO2的孵箱中培养，当细胞融合密度达到70%~80%，换无血清DMEM培养液继续培养24 h，然后将Wi-38细胞分装进行传代培养，随机分为6组继续孵育24 h、48 h、72 h后收集细胞做相关检测：① 对照组，单独的DMEM培养；②5 ng/mL TGF-β组，加入浓度为5 ng/mL的TGF-β孵育；③ 10 ng/mL TGF-β组，加入浓度为10 ng/mL的TGF-β孵育；④ 10 ul/mL CKZ组，加入浓度为10 ul/mL CKZ的孵育；⑤ 20 ul/mL CK组，加入浓度为20 ul/mL CKZ的孵育；⑥ 10 ng/mL TGF-β + 20 ul/mL CKZ组，同时加入浓度10 ng/mL TGF-β和20 ul/mL CKZ孵育。采用实时荧光定量(qPCR)的方法检测孵育24、48、72 h的Wi-38中的TGF-β、collagen 1、α-SMA的表达水平变化。

3.2. 实时荧光定量检测主要实验步骤

① 细胞培养及细胞传代：按照2.1分组培养条件培养细胞系。② 活细胞计数：将制备好的计数用细胞悬液滴入计数板，按照(细胞悬液的细胞数)/mL = (四个大格子细胞数/4) × 2 × 104公式计算细胞密度。③ RNA提取：细胞中加入1 mL Trizol，将细胞裂解吸到一个1.5 mL的EP管中，加入200 ul氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟，12,000 rpm，4℃ 15 min，转上层水相(约400 ul)于新1.5 mL EP管中，加入400 ul异丙醇，混匀，室温静置10 min，12,000 rpm 10 min 4℃弃上清，沉淀用预冷的70%无水乙醇洗3次，空气干燥5~10分钟，溶于20 ul DEPC水中，分光光度计测定RNA浓度；④ RNA cDNA第一链合成：将逆转所需要的物品准备好，RNA浓度计算好，tube准备并标记上，在冰浴的nuclease-free PCR管中加入total RNA、5xTransScript All-in-One SuperMix for qPCR、gDNA Remover、Rnase-free ddH2O，轻轻混匀孵育后，85度加热5秒失活TransScript RT/RI和gDNA Remover。⑤ qPCR检测：将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。配制反应混合液(表1)、设定PCR循环条件(表2)、采用目的基因实时荧光定量PCR引物(表3)。

Table 1. Preparation of reaction mixture

表1. 配制反应混合液

Table 2. PCR cycle conditions

表2. PCR循环条件

Table 3. Real time fluorescence quantification PCR primers for the target gene

表3. 目的基因实时荧光定量PCR引物

4. 统计学方法

应用SPSS22.0版统计软件处理，数据采用 x ¯ ± s表示，采用单因素方差分析，P < 0.05为差异具有统计学意义。

5. 结果

5.1. α-SMA mRNA水平变化

在wi-38细胞中，1) 与对照组(Ctrl)相比，加入TGF-β处理组细胞α-SMA的mRNA水平升高，其差异具有统计学意义(**P < 0.01)，说明TGF-β处理能促进α-SMA的mRNA表达；加入CKZ处理组细胞α-SMA的mRNA水平降低，并呈现一定的浓度依赖性，其差异具有统计学意义(*P < 0.05)，说明CKZ处理能抑制α-SMA的mRNA表达，随着浓度的增加，这一抑制作用加强；2) 与TGF-β处理组相比，同时加入TGF-β和CKZ处理组细胞α-SMA的mRNA水平降低，其差异具有统计学意义(#P < 0.05)，说明TGF-β同时加入CKZ处理能降低TGF-β诱导的α-SMA的mRNA过表达(见表4，图1)。

Table 4. Comparison of mRNA levels of each index

表4. α-SMA、TGF-β、Collagen 1的mRNA水平比较

注：与对照组相比，加入TGF-β、CKZ处理组细胞，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与TGF-β处理组相比，加入TGF-β + CKZ处理组细胞，#P < 0.05。

Figure 1. Comparison of α-SMA mRNA levels

图1. α-SMA的mRNA水平比较

5.2. TGF-β mRNA水平变化

在wi-38细胞中，1) 与Ctrl组相比，加入TGF-β处理组细胞TGF-β的mRNA水平降低，其差异具有统计学意义(**P < 0.01)，说明TGF-β处理能抑制TGF-β的mRNA表达；加入CKZ处理组细胞TGF-β的mRNA水平降低，其差异具有统计学意义(***P < 0.001)，说明CKZ处理能抑制TGF-β的mRNA表达，但未呈现明显的浓度依赖性；2) 与TGF-β处理组相比，同时加入TGF-β和CKZ处理组细胞TGF-β降低，其差异具有统计学意义(#P < 0.05)，说明TGF-β同时加入CKZ处理能回复TGF-β的mRNA表达(见表4，图2)。

5.3. Collagen 1 mRNA水平变化

在wi-38细胞中1) 与Ctrl组相比，加入TGF-β处理组细胞Collagen 1的mRNA水平升高，其差异具有统计学意义(*P < 0.05)，说明TGF-β处理能促进Collagen1的mRNA表达；加入CKZ处理组细胞Collagen 1的mRNA水平降低，并呈现一定的浓度依赖性，其差异具有统计学意义(*P < 0.05)，说明CKZ处理能抑制Collagen 1的mRNA表达，随着浓度的增加，这一抑制作用加强。2) 与TGF-β处理组相比，同时加入TGF-β和CKZ处理组细胞Collagen 1的mRNA水平降低，其差异具有统计学意义(#P < 0.05)，说明TGF-β同时加入CKZ处理能降低TGF-β诱导的Collagen 1的mRNA过表达(见表4，图3)。

5.4. α-SMA、TGF-β、Collagen 1扩增曲线和熔解曲线

PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所绘制的曲线为扩增曲线，从图4、图5、图6中显示出扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高，各管的扩增曲线良好。对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点及不同PCR产物其Tm值得不同，对PCR的特异性进行鉴定。从图4、图5、图6中显示出α-SMA、TGF-β、Collagen 1均显示了单峰，且出峰位置正是该物质的退火温度，证实为该产物发出的荧光，实验结果有效。

Figure 2. Comparison of TGF-β mRNA levels

图2. TGF-β的mRNA水平比较

Figure 3. Comparison of Collagen 1 mRNA levels

图3. Collagen 1的mRNA水平比较

Figure 4. α- SMA amplification curve and melting curve

图4. α-SMA扩增曲线和熔解曲线

Figure 5. TGF-β amplification curve and melting curve

图5. TGF-β扩增曲线和熔解曲线

Figure 6. Collagen 1 amplification curve and melting curve

图6. Collagen 1扩增曲线和熔解曲线

6. 讨论

多种慢性呼吸道疾病的病理基础均伴有气道的损伤及修复、气道上皮的重塑及间质化改变。在这一病理进程中，成纤维细胞在炎症阶段晚期及增值阶段早期发挥了重要的修复作用 [6]，例如哮喘与COPD因慢性炎症而发生大、小气道组织结构破坏和异常修复，导致部分不可逆性改变，即气道重塑。重症哮喘可见近端气道成纤维细胞增多，COPD患者可见小气道平滑肌增厚，胶原及成纤维组织增多 [7] [8]，吸烟的患者可见气道上皮层增厚、基底层上皮细胞过度增生现象 [9]。作为细胞外基质(ECM)的主要合成细胞，成纤维细胞可合成胶原蛋白等多种ECM成分。在胶原蛋白的构成中，I型、III型占80%~90%，Collagen 1被证实为细胞外基质的重要组成成分 [10]。α-SMA属于肌动蛋白中的一种，目前发现支气管平滑肌中存在α、β和γ三种亚型，以α-SMA比例最高，在支气管平滑肌中，α-SMA多聚化为细的肌纤维细胞，以维持细胞的收缩、运动及结构，为成纤维细胞的主要标志物 [11]。因此Collagen 1、α-SMA的表达增多提示气道反应性增高、气道重塑程度加重。TGF-β在炎症反应、组织修复等方面起重要调节作用，动物体内实验表明，局部注射TGF-β可以促进伤口愈合和典型肉芽组织形成。TGFβ1是TGF-β家族中最重要一员，具有刺激成纤维细胞合成和分泌细胞外基质作用, 被认为是上皮间质转化(EMT)转变的一个重要因子，包括上皮细胞向成纤维细胞，肌成纤维细胞转变，同时上皮间质转化释放大量胶原，可引起气道壁收缩狭窄从而导致气道阻塞 [12] [13]。本研究中，用TGFβ干预Wi-38细胞，测定细胞的α-SMA、TGFβ、Collagen 1的mRNA水平，α-SMA及Collagen 1均较对照组显著升高，差异有统计学意义，证实了TGFβ对α-SMA及Collagen 1的促进作用。有研究证实二者均在上皮间质转化时表达上调 [14] [15]，与本研究结果一致。

中医学认为“肺本虚，气为不足，复为邪所乘，雍否不能宣畅，故咳逆短气也。”此时患者气道炎症严重，气道重塑发生，临床表现为“肺肾气虚”型，当治以补肺纳肾，降气平喘为主，喘可治注射液由巴戟天、淫羊藿组成，具有温阳补肾、平喘止咳功效。淫羊藿含有淫羊藿多糖、淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮等多种活性成分，一项Westernblot检测分组大鼠肺组织中TGFβ1、α-SMA表达水平的研究证实淫羊藿苷干预后的大鼠肺组织中TGFβ1和α-SMA表达水平显著下调，说明淫羊藿苷一定程度上抑制了肺纤维化大鼠细胞外基质的胶原纤维沉积 [16]。现代药理研究还证明 [17]，巴戟天提取物具有免疫调节、抗细菌、化痰、平喘、减轻炎性反应、抗过敏等作用。本研究中加入CKZ处理组的Wi-38细胞，其α-SMA、TGFβ、Collagen1的mRNA水平明显降低，其差异具有统计学意义，且α-SMA、Collagen 1的mRNA水平呈现出与喘可治浓度依赖性关系，证实了CKZ对α-SMA、TGFβ、Collagen 1的抑制作用。肺成纤维细胞的过度增生和分泌胶原(主要是Collagen 1与纤维粘连蛋白)在细胞外基质沉积过程中扮演了重要的角色 [18] [19]。抑制成纤维细胞的增殖，抑制其过度地分泌胶原就能在一定程度上缓解气道重塑的进程，这为CKZ改善气道重塑及气道上皮间质转化提供了依据。本研究中同时加入TGF-β和CKZ处理组细胞α-SMA的mRNA水平、Collagen 1的mRNA水平明显降低，与TGF-β处理组相比，其差异具有统计学意义，进一步证实了CKZ的这一作用机制。

临床中，CKZ用于治疗肺肾气虚型喘病，疗效显著。现代研究证实CKZ可以减轻气道炎性反应并改善细胞免疫功能 [20]。而本研究结果发现CKZ对人胚胎肺成纤维细胞的转移因子及相关蛋白具有一定抑制作用，说明CKZ治疗喘病的作用靶点可能与降低TGF-β的高表达、抑制α-SMA 和Collagen 1的激活有关，这可能成为研究气道损伤及修复、气道间质化转变的突破点。

基金项目

空气污染(雾霾)对人群健康影响防治研究，项目编号：361-0402-YSN-ULZ6。

文章引用

闫红倩,耿立梅,于向艳,马蕴蕾. 喘可治注射液对人胚胎肺成纤维细胞转化因子及相关蛋白的影响
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    21. NOTES

    *通讯作者。

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