本研究根据沙门菌 ( Salmonella spp. ) 的 fimA 基因,奇异变形杆菌 ( Proteus mirabilis ) 的 idsC 基因,迟缓爱德华菌 ( Edwardsiella tarda ) 的 fimA 基因设计合成了三对特异性引物,建立一种同时检测三种食源性肠道致病菌的多重 PCR 方法,体系中检测到沙门氏菌的灵敏度为 8 CFU ;体系中检测到奇异变形杆菌的灵敏度为 53 CFU ;体系中检测到迟缓爱德华氏菌的灵敏度为 72 CFU 。对多重 PCR 的反应条件进行优化并组装成快速检测试剂盒。通过对采集的饲料、肉品和水产品等样品的检测,结果表明建立的多重 PCR 方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷等优点,与分离鉴定方法符合率 100% ,为研发快速检测以上三种食源性肠道致病菌的试剂盒提供了重要技术保障。 Three pairs of specific Primers were designed according to the gene fimA of Salmonella spp. , the gene idsC of Proteus mirabilis and the gene fimA of Edwardsiella tarda . They are used to establish multiplex PCR method for diagnosing three species food-borne pathogenic bacteria synchronous. In the system, the detection sensitivity of Salmonella spp, Proteus mirabilis and Edwardsiella tarda was 8 CFU, 53 CFU and 72 CFU respectively. The reaction conditions on the multiplex PCR were optimized and assembled into a rapid detection kit. Through the detection of the samples, such as the feed, meat and aquatic product, the detection results showed that the multiplex PCR method has the advantages of high sensitivity, high specificity and convenience. The coincidence rate was 100 percent with isolation and identification method. It provides an important technical support for the development of rapid detection kit of the above three kinds of food-borne pathogenic bacteria.
沙门菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌在自然界分布广泛,在人和许多动物(包括哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类)的肠道中常有发现,也常见于粪便材料或被粪便污染的地方,常被作为环境和食品等的粪源性污染的卫生细菌学指标[1,2]。这三种菌均可引起食物中毒[3-6]。其中,奇异变形杆菌还是重要的医院内感染菌,常引起尿道逆行性感染和呼吸道感染和其他术部感染[
目前,我国对以上致病菌的检验仍多用分离鉴定方法,鉴定过程复杂,检验周期长,耗费大量人力物力,检验灵敏度也不高。鉴于上述,建立高效灵敏的检验方法对于采取有效的预防和防治措施是很有意义的。本研究选用了负责编码沙门氏菌菌毛蛋白的fimA基因,它是一种重要的毒力因子[
本试验所用标准菌株为:沙门菌、弗氏枸橼酸杆菌、布氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、迟缓爱德华菌、铜绿假单胞杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌。以上菌株均为厦门出入境检验检疫局技术中心动物检验检疫实验室保存(表1)。
25 mmol/L MgCl2,10 × PCR buffer,5 u/μL Taq DNA聚合酶,10 mmol/L dNTP,DL-1500 DNA Marker,购于宝生物工程(大连)有限公司;TE缓冲液(pH 8.0)购于上海生工生物工程有限公司;营养肉汤培
表1. 试验用标准菌株
养基,LB培养基,碱性蛋白胨培养基,营养琼脂培养基,购于北京陆桥技术有限责任公司。其余试剂均为国产分析纯。
稳压稳流电泳仪,PCR扩增仪(型号为PTC200)和凝胶成像仪GelDocXR购于美国BIO-RAD公司。
采用煮沸裂解法,将实验菌株在营养琼脂平板上划线分离,之后在平板上挑取单个菌落接种于营养肉汤增菌液中,于37℃,120 r/min摇床过夜。取增菌后的菌液1 mL于1.5 mL离心管中,12000 r/min离心2 min,弃去上清液,将沉淀用TE缓冲液洗涤两次,洗净培养液。于离心管中加入100 μL TE缓冲液,100℃水浴10 min,立即冰浴5 min,彻底振荡破裂细菌细胞壁,以便释放核酸,13000 r/min离心10 min,取上清分装后−20℃保存以作为实验模板。
根据GeneBank上公布的沙门菌的fimA基因(M18283),奇异变形杆菌的idsC基因(EU635876),迟缓爱德华菌的fimA基因(AF491964)序列,使用Primer Premier 5.0软件分析设计了三对引物,由宝生物工程(大连)有限公司合成。见表2
分别取本实验室保存的沙门菌、奇异变形杆菌和迟缓
表2. 多重PCR引物
爱德华菌(表1所示)作为阳性对照模板,大肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、布氏枸橼酸杆菌、铜绿假单胞杆菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌作为阴性对照模板。用包含所设计的三对引物的混合引物进行PCR反应,测试引物的特异性。
PCR反应体系为12.5 μL,其中包含模板DNA 1 μL,混合引物(浓度为20 μmol/L的三对上、下游引物各0.5 μL混合而成)3 μL,25 mmol/L MgCl2 1.0 μL,10 × PCR Buffer (Mg2+ free)1.25 μL,10 mmol/L dNTP 1.0 μL,5 u/μL Taq酶0.075 μL,双蒸水补足。PCR扩增条件:94℃预变性4 min,94℃变性30 s、58℃退火40 s、72℃延伸40 s,扩增35循环,最后72℃延伸7 min。产物通过2%琼脂糖凝胶电泳判断试验结果。
对影响PCR结果的几个主要反应要素,如退火温度、Mg2+浓度、各引物间的比例、混合引物的浓度、dNTP浓度进行优化,从而确定本检测体系的最优反应条件。
1) 退火温度
PCR反应体系中各成分浓度不变,设计梯度退火温度:52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、64℃,从中选择扩增效果最佳的温度作为最佳退火温度。
2) Mg2+浓度
PCR反应体系各成分浓度不变,退火温度选用之前最优温度,设计加入体系中的25 mmol/L MgCl2体积梯度为0.5 μL、0.75 μL、1.0 μL、1.25 μL、1.5 μL、1.75 μL、2.0 μL,从中选择扩增效果最佳的浓度作为最佳Mg2+添加浓度。
3) 各引物间的比例和混合引物的浓度
使用混合模板DNA(将三种目的菌隔夜培养后,各取1 mL菌液,参照国标法(GB/T4789.2-2003)计算细菌个数,用水煮沸法提取DNA,等量混合作为模板),根据单引物扩增效率进行相应调整。
4) dNTP浓度
PCR反应体系中退火温度、镁离子浓度以及各引物对添加量为上述确定,设计dNTP添加体积梯度为0.5 μL,1.0 μL,1.5 μL,2.0 μL,2.5 μL,3.0 μL。
将三种目的菌隔夜培养后,各取1 mL菌液,参照国标法(GB/T4789.2-2003)计算细菌个数,用水煮沸法提取DNA,等量混合作为模板,按100~106梯度将混合模板稀释后用已优化的PCR体系扩增,测定PCR反应的敏感性。
分别将隔夜培养的沙门氏菌、奇异变形杆菌、迟缓爱德华菌的菌液梯度稀释105~108倍,使最大稀释度下的菌液浓度为每毫升所含的菌体数目为个位数。在相同稀释度的混合菌液中加入10 g冻肉样品,将样品进行预培养,时间为10 h,后分别提取培养菌液的核酸进行多重PCR检测,观察结果。
将表1所列菌株的模板DNA,加入多重PCR反应体系,使用包含表2所列三对引物的混合引物进行反应,通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。通过结果可知,只有沙门菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌三种模板出现与目的条带大小相符的亮带,其余模板均未出现扩增条带,见图1。这说明本实验设计的三对引物具有良好的特异性,可以进行之后的优化。
图1. 多重PCR反应引物特异性试验
设计梯度退火温度:52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃,从中选择扩增效果最佳的温度作为最佳退火温度。见图2,结果显示,54℃、56℃和58℃的时候扩增效果较好,考虑到反应特异性和扩增效率,最终选定56℃为最佳退火温度。
PCR反应体系各成分浓度不变,退火温度选用56℃,设计Mg2+体积梯度为0.5 μL、0.75 μL、1.0 μL、1.25 μL、1.5 μL、1.75 μL、2.0 μL,从中选择扩增效果最佳的浓度作为最佳Mg2+浓度。见图3,结果显示,Mg2+加入体积为1.25 μL的时候,扩增效果最好。
通过比较单引物两两组合的扩增效率,发现沙门菌的引物和迟缓爱德华菌的引物扩增效率差别不大,奇异变形杆菌的引物效率较优。于是设置奇异变形杆菌引物梯度为0.1 μL,0.15 μL,0.2 μL,0.25 μL,0.3 μL分别与1.0 μL沙门氏菌和1.0 μL迟缓爱德华氏菌引物组合,其中沙门菌引物体积为0.8 μL;迟缓爱德华菌引物为1.2 μL。最终确定各引物组分浓度如下:沙门菌上下游引物添加量为0.8 μL,在体系中浓度为1.28 pmol/μL;奇异变形杆菌上下游引物添加量为0.3 μL,在体系中浓度为0.48 pmol/μL;迟缓爱德华菌上下游引物添加量为1.2 μL,在体系中浓度为1.92 pmol/μL。见图4。
PCR反应设计dNTP体积为0.5 μL、1.0 μL、1.5
图2. 多重PCR反应退火温度优化
图3. 多重PCR反应镁离子优化
图4. 多重PCR引物比例优化
μL、2.0 μL、2.5 μL、3.0 μL,从中选择扩增效果最佳的浓度作为最佳dNTP浓度。结果可知,1.5 μL为最佳加入体积。见图5。
经过细菌计数已知,沙门氏菌浓度为8.4 × 108 CFU/mL,奇异变形杆菌浓度为5.3 × 108 CFU/mL,迟缓爱德华菌浓度为7.2 × 108 CFU/mL。通过电泳图可以得知,沙门菌的检测限为8 CFU,奇异变形杆菌的检测限为53 CFU,迟缓爱德华菌的检测限为72 CFU,见图6。
为了测定本体系检测性能的稳定性,将除模板以外的体系组分预先混合后分装与PCR管中,于−70℃保存,每隔30天取出进行反应。9个月内未发现扩增条带有明显减弱,说明本体系具有稳定性好的优点。
结果显示,添加了猪肉样品的105、106、107、108这四个稀释度的菌液的检测结果都为阳性,见图7。说明本体系结果可靠。通过预先增菌10小时,可以检测到的菌体浓度小于10 CFU/mL,具有广泛的应用价值。
多重PCR技术是在单重PCR技术的基础上发展起来的,它所具有的优点非常明显,即可以减少劳动
图5. 多重PCR体系dNTP优化
图6. 多重PCR反应灵敏度优化
图7. 人工染菌检测结果
强度并缩短检测时间[
靶基因的选择直接决定了检测结果的可靠性,本研究选择编码沙门氏菌菌毛结构蛋白的fimA基因,奇异变形杆菌的自我识别基因idsC以及编码迟缓爱德华氏菌菌毛蛋白的fimA基因,通过NCBI在线比对得知它们具有很好的特异性,适合作为检测体系的靶基因,并在特异性试验中得到了证实。
多重PCR体系中由于加入了两对以上的引物,反应条件变得复杂。引物与模板的结合程度的强弱,不同引物之间是否会形成二级结构,都会对扩增效率造成极大的影响。由于多个引物对之间是共享一个反应体系的,还会相互竞争反应原料。引物设计的优劣以及各引物对的添加比例不仅关系到体系的检测灵敏度,还决定了能否达到单管多重检测的目的。
在多重PCR的反应条件中,Mg2+浓度、退火温度和dNTP浓度也起了重要作用。Mg2+浓度过低会阻碍PCR产物扩增,浓度过高又会降低PCR反应的特异性,在非常高的镁离子环境下,PCR反应甚至不能进行。退火温度过低,PCR反应的特异性会减低,结果出现非特异性条带。退火温度过高,又会降低引物的结合效率。所以退火温度的设定要根据实际情况来判断。如果样品中模板的量太少,可以在PCR反应的前几个循环采用低退火温度,促进模板的扩增,增加反应的模板量。之后的循环采用高退火温度,保证最终产物的特异性。dNTP是作为产物扩增的原料添加的,添加量要求能够满足反应需求,但是又不能过量,否则会抑制反应进行。研究中通过对三者分别优化,最终确定最佳反应条件为退火温度56℃下,反应进行35个循环,体系总体积为12.5 μL,包含待检模板DNA 3 μL,浓度为20μmol/L的三对引物加入量分别为沙门氏菌0.8 μL,奇异变形杆菌0.3 μL,迟缓爱德华菌1.2 μL,25 mmol/L MgCl2 1.0 μL,10 × PCR Buffer (Mg2+ free) 1.25 μL,10 mmol/L dNTP Mixture 1.5 μL,5 u/μL Taq酶0.075 μL,双蒸水补足。PCR扩增条件:94℃预变性4 min,94℃变性30 s、58℃退火40 s、72℃延伸45 s,扩增35循环,最后72℃延伸7 min。产物通过2%琼脂糖凝胶电泳判断试验结果。
本研究建立的多重PCR检测体系检测灵敏度为:沙门氏菌8 CFU,奇异变形杆菌53 CFU,迟缓爱德华菌72 CFU。由于PCR法检测病原菌的一般程序都要经过样品前增菌,所以本检测体系的灵敏度足以满足日常检测。在实际检测中应用,从样品制备到得到结果只需要5个小时,若把预先增菌时间也考虑在内,也不用超过一天,这极大提高了检测效率,很符合当前入境口岸快速检验的要求,具有实际应用价值。
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