目的:考察纳米银对大鼠免疫系统的影响以及其他早期全身毒性反应;同时考察纳米银在体外对淋巴细胞炎性因子和免疫因子释放的影响。通过体内外试验的综合研究考察纳米银的潜在免疫系统毒性。方法:SD大鼠经连续灌胃给入低剂量(1 mg/kg)和高剂量(10 mg/kg)纳米银溶液,生理盐水溶液(对照组)。于首次给入后2小时、连续给入7天、14天及停止给入14天后分别处死大鼠,然后进行大鼠体内各脏器银元素定量测定和病理学分析、血液学及血液生化检测、相关免疫因子的检测。体外试验中,在纳米银暴露或非暴露条件下,将淋巴细胞于含或不含脂多糖的培养液中培养24小时,分析IL-6、IL-4、IgG、IgE等的含量,以考察纳米银引起的免疫系统毒性。结果和讨论:纳米银暴露组显示纳米银剂量、时间依存性的在大鼠血液及脏器组织内蓄积。与对照组相比,经口给入高剂量纳米银(10 mg/Kg)引起了大鼠淋巴细胞IgE、IgG与IL-4的显著增加;高、低剂量组给入纳米银14天停止给入14天后,血清IL-6水平与B细胞CD45RA+水平均显著增加。虽然经纳米银灌胃后大鼠组织病理学检查未发现显著的病理改变,但血糖和碱性磷酸酶的升高提示有胰脏和肝脏的损伤。血常规显示血液内银在低浓度时刺激炎性细胞反应性增加;而高浓度时则诱导细胞毒性,抑制了淋巴细胞的正常生长。在体外不同浓度纳米银(0.5 μg/mL,5 μg/mL)作用下,LPS诱导的淋巴细胞分泌IgG和IL-6显著减少。综合体内外实验结果表明,本研究所用的纳米银主要引起了大鼠以Th2型免疫毒性为主的早期全身毒性。 Objective: To investigate the effects on immune system and other systemic toxicity of silver nano-particles (SNPs) in rats by oral exposure, and combined an in vitro study of SNPs on the release of inflammatory cytokines and immune factors in lymphocytes, to get a better understanding about potential immunotoxicity of silver nanoparticles. Methods: SD rats were orally administrated with low-dose (1 mg/kg) and high-dose (10 mg/kg) of SNPs and saline (control) respectively, and the organ and blood samples were harvested after 2 hrs (n = 9), 7 days (n = 18), 14 days (n = 18) ex-posure and14 days of post-exposure (n = 9) for determination of silver content, hematology, blood biochemistry, and immune factor assessment. Lymphocytes were incubated with or without lipo-polysaccharide in the presence or absence of silver nanoparticles for 24 hours in vitro. And IL-6, IL-4, IgG and IgE of cell culture supernatants were analyzed by ELISA. Results and Discussion: SNPs exposure group showed SNPs accumulated time-dose dependently in blood and organs of rats. The IgG (14 days), IgE (14 days) and IL-4 (7 days) of rats after 10 mg/kg SNPs exposure were signifi-cantly increased, and IL-6 and CD45RA+ (B cells) at 14 days post-exposure of SNPs were obviously increased, compared with that in control. But we did not find significant pathological changes. The rise of glucose and ALP suggested damage of pancreas and liver of rats after SNPs oral administra-tion. Low concentration silver in blood increased inflammatory cells in response to the stimuli by blood examination, while high concentration induced cytotoxicity which inhibited the normal growth of lymphocyte. Secretion of IgG and IL-6 induced by LPS of lymphocytes in low-dose and high-dose (0.5 μg/ml, 5 μg/ml) SNPs exposure was inhibited in vitro. In conclusion, our study showed that silver nanoparticles mainly caused a Th2-type immune toxicity-based early systemic toxicity.
邵安良1*,王志杰1,2,陈亮1,徐丽明1#
1中国食品药品检定研究院,北京
2冠昊生物科技股份有限公司,广东 广州
Email: shaoanliang@nifdc.org.cn, #xuliming@nifdc.org.cn
收稿日期:2015年4月15日;录用日期:2015年4月26日;发布日期:2015年4月30日
目的:考察纳米银对大鼠免疫系统的影响以及其他早期全身毒性反应;同时考察纳米银在体外对淋巴细胞炎性因子和免疫因子释放的影响。通过体内外试验的综合研究考察纳米银的潜在免疫系统毒性。方法:SD大鼠经连续灌胃给入低剂量(1 mg/kg)和高剂量(10 mg/kg)纳米银溶液,生理盐水溶液(对照组)。于首次给入后2小时、连续给入7天、14天及停止给入14天后分别处死大鼠,然后进行大鼠体内各脏器银元素定量测定和病理学分析、血液学及血液生化检测、相关免疫因子的检测。体外试验中,在纳米银暴露或非暴露条件下,将淋巴细胞于含或不含脂多糖的培养液中培养24小时,分析IL-6、IL-4、IgG、IgE等的含量,以考察纳米银引起的免疫系统毒性。结果和讨论:纳米银暴露组显示纳米银剂量、时间依存性的在大鼠血液及脏器组织内蓄积。与对照组相比,经口给入高剂量纳米银(10 mg/Kg)引起了大鼠淋巴细胞IgE、IgG与IL-4的显著增加;高、低剂量组给入纳米银14天停止给入14天后,血清IL-6水平与B细胞CD45RA+水平均显著增加。虽然经纳米银灌胃后大鼠组织病理学检查未发现显著的病理改变,但血糖和碱性磷酸酶的升高提示有胰脏和肝脏的损伤。血常规显示血液内银在低浓度时刺激炎性细胞反应性增加;而高浓度时则诱导细胞毒性,抑制了淋巴细胞的正常生长。在体外不同浓度纳米银(0.5 μg/mL,5 μg/mL)作用下,LPS诱导的淋巴细胞分泌IgG和IL-6显著减少。综合体内外实验结果表明,本研究所用的纳米银主要引起了大鼠以Th2型免疫毒性为主的早期全身毒性。
关键词 :纳米银,灌胃,免疫系统毒性,全身毒性
纳米银因具有抗菌杀菌作用而被应用于医疗领域,如:含纳米银敷料、纳米银涂层导管等。然而,具有粒径小、比表面积大、活性强等特点的纳米银在发挥抗菌杀菌作用的同时也会对人体正常组织或细胞产生负作用。大量的体外实验研究提示一定剂量的纳米银具有明显的细胞毒性[
大量体内实验研究证实纳米银能够从各种途经(吸入、口服、皮肤)吸收进入体内,在体内迁移,于不同脏器引起蓄积及大剂量时伴有主要靶脏器(如肝、肺、肾)的损伤 [
当纳米材料穿透人体的自然屏障后发生体内迁移,接触最多的是血液和淋巴系统。有研究报道利用碳纳米管进入血液系统后的免疫刺激作用靶向性治疗肿瘤细胞 [
为考察纳米银引起免疫反应的特征和类型,本研究设计经灌胃给入纳米银溶液,重点考察SD大鼠的免疫系统变化以及其他早期全身毒性反应。同时,设计在体外条件下,考察纳米银对淋巴细胞炎性因子和免疫因子释放的影响,考察纳米银对淋巴细胞的刺激作用或者毒性反应类型。通过体内外试验综合分析纳米银诱导的免疫毒性反应特征和类型,为低剂量纳米银暴露时引起的早期全身毒性风险评价供技术支持。
纳米银溶液(Nanux, Korea);细胞培养液:含10% FBS (Gibco)、2 mM L-谷氨酰胺Sigma)、50 μM beta-巯基乙醇Sigma)、100 U青霉素及100 μg/mL硫酸链霉素(Sigma);RPMI-1640培养基(Hyclone);脂多糖(sigma);聚苯乙烯纳米颗粒:(PS-NP,天津市倍思乐色谱技术开发中心,粒径:50~100 nm)。
血细胞分析仪(Sysmex xt-1800i);低温离心机(Himac CR21G);生化分析仪(Hitachi7080);电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS, Agilent 7500);酶标仪(Thermo 1500);透射电镜(JEM-2100F);粒径电位仪(Malvern, nano ZS)。
选取240~260 g的健康成年雌性SD大鼠(由中国食品药品检定研究院实验动物中心提供) 54只,按照取样时间点随机分成四大组,每大组再均分成对照、低剂量、高剂量3组。对照组灌胃给入1 mL/kg生理盐水;低剂量组灌胃给入1 mg/kg纳米银溶液;高剂量组灌胃给入10 mg/kg纳米银溶液。四组SD大鼠经单次灌胃给入溶液后2小时取样为第1天(n = 9,每组3只)、连续7天灌胃给入溶液后为第7天取样(n = 18,每组6只)、连续灌胃给入溶液14天后为第14天取样(n = 18,每组6只)、连续灌胃给入溶液14天后停止给样,再正常饲养14天后为第28天取样(n = 9,每组3只)。在上述不同时间点将大鼠人道处死,取血及脏器组织,进行血液学、血液生化、炎症因子、免疫因子、淋巴细胞型、免疫器官及其他各器官的重量及组织病理、动物体内银元素定量测定等分析。
将动物处死后取脏器,经生理盐水充分冲洗后每种组织各取1/3分别放入10%福尔马林固定液,用于HE 染色;其余用于银含量检测。
将样本放入消解瓶中,添加3 mL HNO3后放置24 h进行消解;消解后将样本放在通风厨内,加盖密封后低温加热,直至溶液变澄清;再加热接近干燥时停止加热,使其冷却;用超纯净水溶解消解瓶中残余物,并定容至25 mL。利用等离子体质谱仪测定每份定量容液中的银含量,即为每份样本中的银含量,并计算出单位质量(mg)脏器组织的银含量。
取血液每管300 μL,用1.5% EDTA 1:10抗凝,然后采用血细胞分析仪检测。取血液每管700 μL,在常温下2000 g离心15 min,取上清,然后采用生化分析仪进行检测。
先在96孔培养板上包被抗体4℃过夜,然后在室温下洗板及封闭1 h,添加血清及标准品至96孔培养板在室温下反应1 h。然后洗板,加入二抗,在室温下孵育1 h。洗板后,加入染色液进一步反应。最后用2 M H2SO4终止反应。分别对IgG,IgE,IL-4,IL-6,IL-1β,IL-12p40,IL-10进行上机分析。
对大鼠全血进行裂解红细胞后通过特异荧光标记单克隆抗体对淋巴细胞进行染色,运用流式细胞仪对细胞进行亚群分析。组合如下:CD3 FITC/CD80 PE/CD8a PerCP/CD4 APC,AlexaFluor488 CD45RA/ CD80 PE/AlexaFluor647 CD161。按照说明书操作待上机分析。
参考美国癌症研究院纳米材料表征实验室建立的方法(NCL Method ITA-10)。选取5 μg/ml纳米银作为高浓度;0.5 μg/ml纳米银作为低浓度;5 μg/ml聚苯乙烯纳米颗粒(PS-NP)作为对照组;培养液组作为空白组。按照说明书中检测步骤进行,用ELISA方法分析IL-1β、IL-12p40、IL-10、IL-6、IL-4、IgG、IgE的含量。
利用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)表征纳米银的颗粒形态及粒径分布。如图1(a),图1(b)所示,纳米银颗粒呈圆形,分散状态良好。图1(c)~(e)结果表明纳米银溶液在水中分散良好,粒径分布在7~45 nm,以10 nm左右为主;而在模拟胃液中粒径分布以10~25 nm为主,发生了部分团聚现象。
不同取样点的血液及脏器组织内银含量经ICP-MS方法测定,其结果如图2所示。图2(a)显示纳米银
比血液内银含量呈现蓄积性增加,因此血液内的银在低浓度时刺激炎性细胞反应性增加;而高浓度时则诱导细胞毒性,抑制了淋巴细胞的正常生长。这一结果提示,机体摄入纳米银的量不同可能会引起完全不同的毒性风险。
血液生化异常检测结果见表2。在纳米银单次灌胃给入的高剂量组和连续灌胃给入七天时的低剂量组均检测到了血糖的升高,提示胰脏可能受到了一定的影响。在纳米银单次灌胃给入和连续灌胃给入七天时的高剂量组分别检测到了磷酸酶的增高和谷草转氨酶的显著降低,提示肝脏可能受到了一定的影响。
大鼠血清免疫因子检测结果见图3,结果表明纳米银连续灌胃给入十四天时,高剂量组(与对照组相比)血清总IgG、IgE水平显著增高。纳米银连续灌胃给入七天时,高剂量组(与对照组相比)血清IL-4水平显著增高。在纳米银连续灌胃给入十四天后停止给入十四天时,高剂量组(与对照组相比)血清IL-6显著性增高,但在纳米银连续灌胃给入十四天时并没有检测到显著性增高。其在停止给入十四天后在高剂量组的高表达的原因未见相关报道。
大鼠血清IL-12p40,IL-1β检测结果在各组间没有显著性差异。所有大鼠的血清样本IL-10均在检测限以下。
如图4所示,纳米银经灌胃连续7天暴露后各淋巴细胞分型检测与对照组相比未见明显异常。纳米银连续14天暴露后高剂量组的Th细胞(CD3+CD4+) (与对照组相比)有明显的增加,但未达到显著性差异(p = 0.052)。低剂量组的B细胞(CD45RA+) (与对照组相比)有增高趋势;其它各淋巴细胞分型检测与对照组相比未见明显异常。连续14天暴露后停止暴露,继续饲养14天后,高剂量组、低剂量的组B细胞(CD45RA+) (与对照组相比)均显著增加(高剂量组p = 0.001:低剂量组p = 0.032),其它各淋巴细胞分型检测与对照组相比未见明显异常。
如图5所示,在LPS诱导条件下,低剂量和高剂量纳米银(0.5 μg/ml,5 μg/ml)均抑制了LPS诱导的IgG和IL-6的分泌;但聚苯乙烯纳米颗粒没有引起显著性的减少。这一结果提示,纳米银引起淋巴细胞在LPS诱导下的IgG分泌的抑制主要由纳米银释放的银离子的毒性引起,银纳米级颗粒可能起到了协同作用。单纯的纳米级颗粒并不会引起淋巴细胞的毒性和刺激作用。
在LPS诱导条件下,聚苯乙烯纳米颗粒显著抑制了IL-12p40的释放,而纳米银高低剂量组均未见显著性变化。这一现象可能与纳米颗粒的粒径不同有关,聚苯乙烯纳米颗粒的粒径是50~100 nm,而纳米银的
Statistic method | n | Object | Group | Average | Std | Sig. | |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Day 1 | ANOVA-Dunnet-t | 3 | Glucose | High-dose | 3.22 | 0.89 | 0.02 |
3 | Phosphate | High-dose | 3.22 | 1.02 | 0.035 | ||
Day 7 | Games-Howell | 6 | Glucose | Low-dose | 1.43 | 0.44 | 0.036 |
ANOVA-Dunnet-t | 6 | AST | High-dose | −37 | 12.16 | 0.015 | |
Day 14 | ANOVA-Dunnet-t | 6 | Cl | Low-dose | 0.47 | 0.15 | 0.017 |
表2. 纳米银暴露后大鼠血液生化异常检测结果(与对照组比较)
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