本文的目的是建立艾叶的HPLC指纹图谱鉴别方法,评价艾叶及其混淆品HPLC指纹图谱的相似性。采用RP-HPLC法,以Uitimate-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱为分析柱,流动相为乙腈-0.05%磷酸水,梯度洗脱,流速0.60 mL/min,290 nm波长下测定艾叶及其混淆品指纹图谱,并作相似度比较分析。结果建立了艾叶药材HPLC指纹图谱共有模式,有43个共有指纹峰被标定,且相似度较高,艾叶与其混淆品药材的HPLC指纹图谱有明显差异。实验结果表明HPLC指纹图谱具有方法简便,重复性好,特征性强的特点,可用于艾叶药材鉴别。 The purpose of this study was to establish HPLC fingerprint method for identification of argy wormwood leaf. Adopting RP-HPLC method, a uitimate-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) column as the analytical column with mobile phase consisting of acetonitrile-0.05% phosphoric acid water, and gradient elution, under the flow rate of 0.60 mL/min at the wavelength of 290 nm, fingerprints of argy wormwood leaf and its adulterant were established, and then similarity comparison analysis was done. Finally we established the HPLC fingerprint’s common pattern of argy wormwood leaf, and 43 common peaks were calibrated, whose similarity was high. There was a significant difference of HPLC fingerprint between argy wormwood leaf and its adulterant. The results showed that HPLC fingerprint was simple and convenient, with good repeatability and strong characteristics, which could be used to identify argy wormwood leaf medicine.
王远敏,吴红梅,杨烨,田锦忠,王祥培*
贵阳中医学院,贵州 贵阳
Email: *wxp0123@126.com
收稿日期:2015年7月13日;录用日期:2015年7月30日;发布日期:2015年8月7日
本文的目的是建立艾叶的HPLC指纹图谱鉴别方法,评价艾叶及其混淆品HPLC指纹图谱的相似性。采用RP-HPLC法,以Uitimate-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱为分析柱,流动相为乙腈-0.05%磷酸水,梯度洗脱,流速0.60 mL/min,290 nm波长下测定艾叶及其混淆品指纹图谱,并作相似度比较分析。结果建立了艾叶药材HPLC指纹图谱共有模式,有43个共有指纹峰被标定,且相似度较高,艾叶与其混淆品药材的HPLC指纹图谱有明显差异。实验结果表明HPLC指纹图谱具有方法简便,重复性好,特征性强的特点,可用于艾叶药材鉴别。
关键词 :艾叶,HPLC,指纹图谱,鉴别
艾叶为菊科植物艾Artemisia argyi Levl. et Vant.的干燥叶,具有温经止血,散寒止痛,祛湿止痒的功效,用于治疗吐血,衄血,崩漏经多,妊娠下血少腹冷痛,经寒不调,宫冷不孕,外治皮肤瘙痒等症 [
艾叶药材样品共16份,经贵阳中医学院王祥培教授鉴定为菊科植物艾Artemisia argyi Levl. et Van.的干燥叶;艾叶混淆品4份,经贵阳中医学院王祥培教授鉴定为菊科植物野艾蒿A. lavandulaefolia DC.和北艾A. vulgaris L.的干燥叶;艾茎1份,经贵阳中医学院王祥培教授鉴定为菊科植物艾Artemisia argyi Levl. et Van.的干燥茎。具体来源见表1。
Agilent1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦),配有二极管阵列(DAD)检测器,四元泵溶剂洗脱系统,柱温箱,自动进样器;分析天平(型号:AL204-IC/万,METTLER TOLEDO仪器有限公司);超声波清洗机(型号:HS-10260T,天津市恒奥科技发展有限公司);数显恒温水浴锅(型号:HH-6,常州澳华仪器有限公司)。《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》(国家药典委员会 2004A 版),甲醇、乙腈为色谱纯(美国TEDIA),其余试剂均为分析纯,水为娃哈哈纯净水。
No. | 样品 | 品种 | 部位 | 来源 | 相似度 |
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S1 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 贵州开阳上坝 | 0.963 |
S2 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 云南保山一心堂药房 | 0.982 |
S3 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 贵州贵阳芝林大药房 | 0.986 |
S4 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 河南郑州济仁堂药房 | 0.967 |
S5 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 河南郑州仟禧堂药房 | 0.993 |
S6 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 湖南长沙青苹果健康药房 | 0.994 |
S7 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 贵州贵阳万东桥药市 | 0.984 |
S8 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 重庆华博健康药房 | 0.976 |
S9 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 贵州贵阳花果园药市 | 0.988 |
S10 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 河南郑州张仲景大药房 | 0.992 |
S11 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 贵州贵阳北京同仁堂药房 | 0.994 |
S12 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 重庆桐君阁大药房 | 0.996 |
S13 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 四川成都太极大药房 | 0.994 |
S14 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 重庆万和大药房① | 0.995 |
S15 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 重庆万和大药房② | 0.992 |
S16 | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 叶 | 重庆科渝大药房 | 0.901 |
A | 艾叶 | A. argyi Levl. et Van. | 茎 | 贵州开阳上坝 | 0.549 |
B | 艾叶混淆品 | A. lavandulaefolia DC. | 叶 | 贵州贵阳乌当区水田 | 0.541 |
C | 艾叶混淆品 | A. lavandulaefolia DC. | 叶 | 贵州剑河革东镇大皆道村 | 0.436 |
D | 艾叶混淆品 | A. vulgaris L. | 叶 | 贵州剑河岑松镇屯州村 | 0.229 |
E | 艾叶混淆品 | A. vulgaris L. | 叶 | 贵州剑河革东镇麻栗村 | 0.528 |
表1. 艾叶与混淆品的相似度
Uitimate-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)进行线性梯度洗脱(0~8 min, 1%~15% A; 8~18 min, 15%~20% A; 18~36 min, 20%~23% A; 36~45 min, 23%~28% A; 45~60 min, 28%~45% A; 60~80 min, 45%~50% A; 80~90 min, 50%~75% A; 90~100 min, 75%~95% A; 100~110 min, 95%~100% A; 110~120 min, 100% A);柱温 25 ℃ ;检测波长290 nm;流速0.60 mL/min;分析运行时间120 min;进样量5 μL。
取艾叶样品粉末1.0 g,精密称定,置于100 mL具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,超声提取两次,每次1 h,滤过,合并滤液,置蒸发皿中于 60 ℃ 水浴挥干,残渣用甲醇溶解并定容至10 mL,摇均,用0.22 μm微孔滤膜滤过,即得。
取贵州开阳上坝的艾叶样品粉末,精密称定,按2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下的色谱条件连续进样6次,结果显示各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别在0.12%~2.77%和0.03%~1.17%之间,表明仪器精密度良好,符合指纹图谱要求。
取贵州开阳上坝的艾叶样品粉末,精密称定,按2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下的色谱条件分别在0, 6, 12, 18, 24, 36 h进样检测,结果显示各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别在0.08%~2.17%和0.07%~1.40%之间,表明样品溶液在36 h内稳定。
取贵州开阳上坝的艾叶样品粉末6份,精密称定,按2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下的色谱条件进样分析,结果显示各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别在0.14%~2.77%和0.04%~1.28%之间,表明该方法重复性良好。
取16批艾叶药材粉末,精密称定,按2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下的色谱条件对16批供试品溶液进行检测,测得所有供试品HPLC的色谱图;根据不同供试品测定结果的峰数目、峰值、峰位等相关参数进行比较、分析,制定优化的药材指纹图谱,结果见图1,图2。取4批混淆品及1批艾茎药材粉末,按艾叶的方法制备供试品溶液,进样,获得4批混淆品及1批艾茎药材样品的指纹图谱,见图3。
比较不同艾叶药材供试品溶液色谱图的相关参数,以保留时间约为43.617 min的27号峰作为参照峰S,对各批次艾叶药材的指纹图谱进行考察,确定了43个共有峰,结果见图1,图2。
分别将收集的16批艾叶药材样品的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”,进行匹配,时间窗为0.20,采用中位数法考察色谱峰相似度的一致性,结果见表1。分别将4批混淆品及1批艾茎样品的色谱数据导入相似度评价软件,与16批艾叶样品的色谱峰相似度进行比较,结果见表1。根据相似度评价结果,16批艾叶药材样品的相似度大于0.900,而混淆品及艾茎与艾叶比较却低于0.550。
本实验采用超声和回流提取结合以不同浓度的甲醇与乙醇进行提取考察,发现以甲醇作为溶剂进行超声提取的效率高且色谱峰多,提取2次,每次1 h后基本完全,故拟定本文的供试品溶液制备方法。
对乙腈-水、乙腈-0.10%醋酸水、甲醇-水、甲醇-0.10%醋酸水、甲醇-0.05%磷酸水系统、乙腈-0.05%磷酸水系统及甲醇:乙腈(1:1)-0.05%磷酸水等流动相系统进行考察,发现在乙腈-0.05%磷酸水系统条件下,供试品各峰的分离度较好,基线平稳。采用DAD多通道波长检测,发现在290 nm检测波长条件下,信息量丰富,特征峰较明显。考察 25 ℃ 、 30 ℃ 、 35 ℃ 时柱温条件对色谱峰分离度的影响,发现柱温升高时,峰的分离度降低且分析时间延长,故选择 25 ℃ 作为柱温。
图1.艾叶药材HPLC指纹图谱
图2. 16批艾叶药材HPLC指纹图谱
图3. 艾叶药材与混淆品的HPLC指纹图谱比较图
文献[
王远敏,吴红梅,杨 烨,田锦忠,王祥培. 艾叶药材HPLC指纹图谱的鉴别研究 Identification of Argy Wormwood Leaf by HPLC Fingerprint[J]. 药物资讯, 2015, 04(03): 35-41. http://dx.doi.org/10.12677/PI.2015.43005