本研究探索载骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)的左旋聚乳酸(PLLA)载药微球的制备条件,并检测BMP-2- PLLA微球中BMP-2的释放规律和生物活性。采用乳化法制备载牛血清白蛋白(BSA)的聚乳酸(PLLA)载药微球,考察PLLA分子量、PLLA浓度、PEG分子量对PLLA载药微球粒径、包封率和载药量的影响,选择优化条件制备载BMP-2的PLLA微球,通过细胞合成ALP检测BMP-2的活性。实验制备的BMP-2-PLLA微球表面光滑,粒径为4.815 μm,载药量为2.28 × 10−3%,包封率为70.88%,二氯甲烷残留量为0.0041%。BMP-2-PLLA微球有效实现了BMP-2长期稳定缓慢释。乳化过程未对BMP-2活性产生显著影响,且BMP-2-PLLA微球中释放的BMP-2对细胞合成ALP的诱导作用较BMP-2溶液更加显著。实验制备的PLLA微球可用于负载生长因子实现缓释,并能较好地维持其生物学活性。 The preparation conditions of poly-l-lactide (PLLA) microspheres, release characteristics and bi-oactivity of Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) were studied. Bovine serum albumin (BSA)- loaded PLLA microspheres were prepared with a double emulsion method. The effects of the mo-lecular weight and concentration of PLLA, the molecular weight of PEG on the particle size, loading capacity and entrapment efficiency were studied. Then, the optimal conditions were selected to prepare BMP-2-loaded PLLA microspheres, and the bioactivity of BMP-2 was investigated by pro-duction of cell Alkaline Phosphatase (ALP). The results showed that the BMP-2-PLLA microspheres were spherical shape with diameters of 4.815 μm. The encapsulation efficiency of the BMP-2 in PLLA microspheres was 70.88%, and the loading capacity was 2.28 × 10−3%. The residual amount of methylene chloride in BMP-2-PLLA microsphere was 0.0041%. BMP-2-loaded PLLA microspheres had excellent drug sustained-release performance, which would control release BMP-2. BMP-2 biological activity indicated that the biological activity was not effected after emulsion process. The bioactivity of growth factors released from PLLA microspheres was more durable and effective. PLLA microspheres prepared can be used to load growth factors to control their release and maintain their biological activity.
白燕*,肖唯
重庆医科大学药学院,重庆
收稿日期:2016年7月5日;录用日期:2016年7月25日;发布日期:2016年7月28日
本研究探索载骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)的左旋聚乳酸(PLLA)载药微球的制备条件,并检测BMP-2- PLLA微球中BMP-2的释放规律和生物活性。采用乳化法制备载牛血清白蛋白(BSA)的聚乳酸(PLLA)载药微球,考察PLLA分子量、PLLA浓度、PEG分子量对PLLA载药微球粒径、包封率和载药量的影响,选择优化条件制备载BMP-2的PLLA微球,通过细胞合成ALP检测BMP-2的活性。实验制备的BMP-2-PLLA微球表面光滑,粒径为4.815 μm,载药量为2.28 × 10−3%,包封率为70.88%,二氯甲烷残留量为0.0041%。BMP-2-PLLA微球有效实现了BMP-2长期稳定缓慢释。乳化过程未对BMP-2活性产生显著影响,且BMP-2-PLLA微球中释放的BMP-2对细胞合成ALP的诱导作用较BMP-2溶液更加显著。实验制备的PLLA微球可用于负载生长因子实现缓释,并能较好地维持其生物学活性。
关键词 :左旋聚乳酸,微球,骨形态发生蛋白,缓释,生物活性
由创伤、感染、肿瘤引起的骨缺损是临床常见的病症。骨缺损的再生和修复过程需要多种生长因子的协同调控,适时适量补充外源性生长因子能够有效地促进骨缺损的修复。其中,骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)是目前已知效应最强、应用最广泛的骨生长因子 [
聚乳酸(PLA)以其优越的生物相容性、生物安全性和可降解性,在生物医学工程领域得到广泛的研究和应用 [
PLLA (济南岱罡生物工程有限公司),聚乙烯醇(PVA,Sigma公司),聚乙二醇(PEG,成都市科龙化工试剂厂) BCA试剂盒(南京建成),BMP-2 (Peprotech),BMP-2-ELISA试剂盒(RD进口分装)
采用乳化法制备PLLA微球 [
分别采用分子量为10、50、100 KDa的PLLA制备载BSA的PLLA微球,其它条件不变,考察PLLA分子量对PLLA微球的影响。
分别采用浓度为50 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL的PLLA制备载BSA的PLLA微球,其它条件不变,考察PLLA浓度对载药微球的影响。
分别采用分子量为400、1000、4000的PEG制备载BSA的PLLA微球,其它条件不变,考察PEG分子量对载药微球的影响。
PLLA载药微球的形貌通过扫描电镜观察,取一定微粒用导电胶粘在载物台上,喷金后观察。微球粒径大小及粒径分布采用激光粒度仪测定。一定量的样品加入样品池,经超声分散后启动仪器循环泵,自动分析软件即可获得微粒粒径大小及粒径分布。
精确称量适量的BSA-PLLA载药微球,加入二氯甲烷适量,磁力搅拌直至聚乳酸完全溶解,再加入定量高纯水,搅拌同时缓慢升温,待二氯甲烷挥发完全,溶液经0.22 µm微孔滤膜滤过,采用BSA试剂盒测试BSA浓度。BMP-2含量的测定采用酶联免疫吸附法定量检测试剂盒。根据2010年版《中华人民共和国家药典》规定,载药量和包封率分别按以下公式计算:
精密称取BSA-PLLA 60 mg置于预先处理好的透析袋中,在袋中加入2 mL磷酸缓冲液(pH 7.2)溶液,封口后将透析袋浸没于盛有PBS的试剂瓶中。试剂瓶置于37℃水平恒温振荡器(频率100 r/min),开始计时。在预定的时间取样1 mL,同时补加1 mL空白PBS,采用BSA试剂盒测试BSA浓度。BMP-2含量的测定采用酶联免疫吸附法定量检测试剂盒。用标准曲线求出药物浓度并换算成不同时间的计算累积释放率,绘制累计释放量与时间的曲线。
精密称取PLLA载药微球100 mg,以二氯甲烷标准品为对照,采用气相色谱顶空法检测其二氯甲烷残留量。
BMP-2-PLLA微球释放出的BMP-2的生物活性通过其对成骨细胞(MG63)碱性磷酸酶(ALP)合成的影响进行考察。将细胞接种于96孔细胞培养板中,置于37℃,5% CO2细胞培养箱培养24小时,然后按照实验分组:1) 对照组:仅加入培养基,2) Free-BMP-2组:培养基中直接加入BMP-2,3) BMP-2-PLLA组:培养基中加入BMP-2-PLLA微球。培养7天,采用ALP检测试剂盒检测细胞分泌ALP的浓度。
不同PLLA分子量对PLLA载药微球粒径、载药量、包封率的影响见表1。随着PLLA分子量的增大,微球粒径逐渐增大,BSA包封率逐渐减小而载药量逐渐增大。
不同PLLA浓度对PLLA载药微球粒径、载药量、包封率的影响见表2。随着PLLA浓度的增大,微球粒径逐渐增大,BSA包封率逐渐增大而载药量逐渐减小。
不同PEG分子量对PLLA载药微球粒径、载药量、包封率的影响见表3。随着PEG分子量的增大,微球粒径逐渐减小,BSA包封率和载药量都逐渐增大。
根据不同制备条件对PLLA载药微球粒径、载药量、包封率的影响,为了制备大小适宜、包封率和载药量较高的PLLA载药微球,最终选择分子量为10 KDa,浓度为50 mg/mL的PLLA,分子量为4000的PEG来制备BMP-2-PLLA微球。由图1可见,BMP-2-PLLA微球的形态规则,表面光滑,大小均一。BMP-2-PLLA微球的平均粒径为4.815 μm,BMP-2-PLLA微球的理论载药量为3.99 × 10−3%,实际载药量为2.28 × 10−3%,包封率为70.88%。
本研究以二氯甲烷标准品为对照,采用顶空法测得BMP-2-PLLA微球中二氯甲烷残留为0.0041%,远低于中华人民共和国药典(2010)限度规定(0.06%)。由此可见,本实验中所采用的制备方法和条件可以制得有机溶剂残留量低的常用的高分子微球。
分别制备BMP-2-PLLA和BSA-PLLA载药微球,在不同时间点检测溶出介质PBS中BMP-2和BSA的浓度,计算累计释放率,如图2。24小时,BMP-2和BSA的累计释放率分别为55.797%和45.976%;7天时,BMP-2和BSA的累计释放率分别为87.357%和77.789%;14天时,BMP-2和BSA的累计释放率分别为93.104%和83.451%;21天时,BMP-2和BSA的累计释放率分别为94.395%和90.268%。
采用ALP检测试剂盒检测MG63细胞合成ALP的情况,见图3。细胞培养1天后,BMP-2-PLLA载药微球中释放出的BMP-2较空白对照组和直接在培养液中加入BMP-2组,显著促进MG63细胞合成ALP (P < 0.05),直接在培养液中加入BMP-2组与空白对照组没有显著差异。培养7天后,直接在培养液中加入BMP-2和BMP-2-PLLA载药微球中释放出的BMP-2都能够显著促进ALP合成,且BMP-2-PLLA微球中释放的BMP-2对MG63细胞合成ALP的诱导作用更加显著(P < 0.01)。
PLLA Mw | 10 KDa | 50 KDa | 100 KDa |
---|---|---|---|
粒径(μm) 载药量(%) | 2.409 0.181 | 4.771 0.161 | 45.825 0.113 |
包封率(%) | 76.201 | 78.101 | 78.573 |
表1. 不同分子量PLLA制得的BSA-PLLA载药微球的粒径、载药量、包封率
PLLA (mg/mL) | 50 | 100 | 150 |
---|---|---|---|
粒径(μm) 载药量(%) | 2.512 0.164 | 5.001 0.135 | 10.49 0.109 |
包封率(%) | 73.596 | 77.291 | 77.937 |
表2. 不同浓度PLLA制得的BSA-PLLA载药微球的粒径、载药量、包封率
PEG Mw | 400 | 1000 | 4000 |
---|---|---|---|
粒径(μm) 载药量(%) | 6.550 0.103 | 2.989 0.105 | 2.583 0.110 |
包封率(%) | 58.881 | 75.291 | 76.948 |
表3. 不同分子量PEG制得的BSA-PLLA载药微球的粒径、载药量、包封率
图1. BMP-2-PLLA载药微球的扫描电镜图
图2. BMP-2-PLLA、BSA-PLLA载药微球的释放曲线
图3. BMP-2-PLLA载药微球中释放出的BMP-2的生物活性
利用具有骨诱导活性的人工骨促进大段骨缺损的修复和再生是近年来研究的热点 [
实验考察了乳化法制备PLLA载药微球过程中影响微球粒径、蛋白药物载药量和包封率的几个主要因素。结果表明,BSA-PLLA微球的平均粒径与PLLA的相对分子量的大小有关。在实验考察范围内,BSA-PLLA微球的平均粒径随着聚乳酸相对分子量的增大而增大。这是由于PLLA在二氯甲烷中溶解性良好,相对分子量越低结晶度相对较低,溶解度较大。在微球形成过程中,随着二氯甲烷的挥发,相对分子量低的PLLA沉积速率较慢,成球速度较慢,相对分子量较高的聚乳酸结晶度相对较高,沉积速率快,但随着分子量的增大,但在乳化过程中油相的粘度就越大,在其他条件相同的情况下,致使乳化过程的分散程度降低,增加了溶剂挥发过程中乳液液滴碰撞发生聚集的可能性,从而产生一些粒径较大的微球 [
理想的药物缓释载体应具有稳定的药物释放速率,以达到药物最大的生物学性能 [
保持生长因子的生物活性是本研究的关键。在BMP-2-PLLA微球的制备过程中,需使用少量的有机溶剂,但微球经过低温搅拌和反复洗涤后,充分挥发去除了制备过程使用的二氯甲烷,大大降低二氯甲烷的残留量,减少或避免了有机溶剂可能带来的毒副作用,最终制得有机溶剂残留量非常低的PLLA微球。从细胞ALP合成的结果可知,BMP-2-PLLA对细胞ALP的合成具有显著地促进作用,证明制备过程保持了BMP-2的生物活性。而且,BMP-2-PLLA对细胞合成ALP的诱导作用较直接应用BMP-2水溶液更显著,原因是BMP-2-PLLA中持续释放BMP-2,充分发挥了BMP-2的生物活性。
本研究制备的BMP-2-PLLA微球简单易行,且能够持续缓慢释放BMP-2并有效地维持其的生物活性,为构建多因子缓释系统,发挥它们之间的协同调控作用奠定基础。
国家自然科学基金资助项目(编号:81401535)。
白 燕,肖 唯. BMP-2-PLLA缓释微球的制备及其对BMP-2活性的维持 Preparation of BMP-2-PLLA Microspheres and Its Maintenance for Bioactivity of BMP-2[J]. 材料科学, 2016, 06(04): 268-275. http://dx.doi.org/10.12677/MS.2016.64035