异养硝化–好氧反硝化细菌的氮响应机制对研究生物脱氮技术具有重要意义。通过分析异养硝化–好氧反硝化细菌X3 (Halomonas alkaliphila)生化周期与培养液中氮形态的关系,对该菌的脱氮机制进行了研究。结果表明:1) 含混合形态氮培养液中,细菌X3在对数生长期主要进行有机氮的降解;整个周期中,氨氮先升高后降低,48 h达到最高值,亚硝酸氮先升高后降低,第4天达到最高值,硝酸氮表现为先下降,48 h后上升的变化趋势,96 h总氮去除率为17.07%;2) 仅含无机氮的培养液中,细菌X3在对数生长期主要进行氨氮和硝酸氮的降解;整个周期中,氨氮和硝酸氮持续下降,亚硝酸氮先升高后降低,24 h达到最高值,96 h总氮去除率可达51.13%。结论:细菌X3的氮降解优先顺序和最终效能皆受控于环境氮化合物形态。本研究有望为生物脱氮工程设计提供理论指导。 For the development of biological denitrification technique, study on the response mechanism of heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria to nitrogen forms has great significance. Herein the relationship between the nitrogen form and the denitrification activity of Halomonas alkaliphila X3 was studied by monitoring the change of different nitrogen forms in the culture so-lution, and the results are as follows. 1) In the culture solution containing both organic nitrogen and inorganic nitrogen, Halomonas alkaliphila X3 mainly degrades organic nitrogen during the logarithmic growth period. Over the whole culture cycle, the concentration of ammonia nitrogen rises up in the first 48 h, followed by a decreasing trend; the concentration of nitrite nitrogen rises up in the first 4 d, followed by a decreasing trend; while the concentration of nitrate nitrogen de-creases in the first 48 h, followed by a decreasing trend. In total 17.07% nitrogen is removed from the culture solution after a treatment for 96 h. 2) In the culture solution containing only inorganic nitrogen, the bacteria mainly degrades ammonia nitrogen during the logarithmic growth period. Over the whole culture cycle, the concentration of ammonia and nitrate nitrogen keeps down; the concentration of nitrite nitrogen rises up in the first 24 h, followed by a decreasing trend. In total 51.13% nitrogen is removed from the culture solution after a treatment for 96 h. In conclusion, the priority and efficiency of the nitrogen degradation by Halomonas alkaliphila X3 both depend on the initial nitrogen forms in the culture solution. These outcomes are promising to help the construction of biological denitrification engineering.
张 艳,成 钰,费聿涛,李秋芬*
中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东 青岛
收稿日期:2016年11月3日;录用日期:2016年12月5日;发布日期:2016年12月8日
异养硝化–好氧反硝化细菌的氮响应机制对研究生物脱氮技术具有重要意义。通过分析异养硝化–好氧反硝化细菌X3 (Halomonas alkaliphila)生化周期与培养液中氮形态的关系,对该菌的脱氮机制进行了研究。结果表明:1) 含混合形态氮培养液中,细菌X3在对数生长期主要进行有机氮的降解;整个周期中,氨氮先升高后降低,48 h达到最高值,亚硝酸氮先升高后降低,第4天达到最高值,硝酸氮表现为先下降,48 h后上升的变化趋势,96 h总氮去除率为17.07%;2) 仅含无机氮的培养液中,细菌X3在对数生长期主要进行氨氮和硝酸氮的降解;整个周期中,氨氮和硝酸氮持续下降,亚硝酸氮先升高后降低,24 h达到最高值,96 h总氮去除率可达51.13%。结论:细菌X3的氮降解优先顺序和最终效能皆受控于环境氮化合物形态。本研究有望为生物脱氮工程设计提供理论指导。
关键词 :异养硝化–好氧反硝化细菌,有机氮,无机氮,氮形态,响应机制
近年来水产养殖业的快速发展,在取得显著经济效益的同时,对生态环境也造成了严重污染。尤其是氮、磷营养元素更是超过了水体的自净负荷,导致一系列环境污染现象 [
自Robertson和Kuenen [
课题组自象山湾浅海网箱养殖区富营养沉积环境中筛选到了一株中度耐盐异养硝化–好氧反硝化细菌X3,经鉴定属于嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)。该菌能够同时降解无机氮和有机氮,环境适应性较强,具有良好的应用前景。前期已行了异养硝化、好氧反硝化能力检测及环境适应性研究。本文针对废水中不仅存在无机氮,还存在有机氮的问题,研究该菌对不同氮形态的响应,找到优先利用的氮形态,明确氮形态对异养硝化和好氧反硝化反应的影响,为其在水产养殖水体净化中的应用提供理论依据。
异养硝化–好氧反硝化细菌X3是实验室在前期研究中筛选并保存的菌种,经中国科学院微生物研究所鉴定为嗜碱盐单胞菌Halomonas alkaliphila。
测试液1:100 mg/L(NH4)2SO4、100 mg/L KNO3、100 mg/LNaNO2、0.5 g/L蛋白胨,加入1 L海水,高压蒸汽灭菌;葡萄糖用0.22 um的醋酸纤维素酯微孔滤膜过滤后,加入测试液中使其终浓度达到64 mg/L。所用试剂均为分析纯。
测试液2:测试液1去掉0.5 g/L蛋白胨,其余试剂相同。
细菌生长培养基:Zobell氏2216E海水培养基。
细菌活化后按5%活的量接种于300 mL新鲜2216 E液体培养基中,28℃、120 rpm/min摇床培养,间隔一定的时间采样,利用7230 G分光光度计在600 nm处检测菌体细胞OD值,建立t-OD600值曲线方程。采样时间为前2 h间隔30 min,2 h~4 h间隔1 h,其后间隔2 h。
细菌X3在2216E培养基中培养24 h后,离心倒掉上清液,在沉淀中加入灭菌蒸馏水,将菌体重新悬浮,按照一定的比例加入上述测试液中,每隔24 h,每个浓度各取一组进行离心,然后用TOC分析仪分析离心前后测试液中总氮含量,两者之差为菌体含氮量;菌体生长情况测量采用吸光度法,用可见分光光度计于600 nm测量吸光度值OD600,建立OD600与菌体氮的线性曲线。
在降解液测试中加入一定浓度的菌液,每隔24 h分别进行氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮和总氮(含菌体氮)。其中氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮的测量方法参照海洋监测规范GB17378.4-2007,氨氮采用次溴酸盐氧化法测定,亚硝酸氮采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定,硝酸氮采用锌–隔还原法测定,总氮测量使用总有机碳(total organic carbon TOC)分析仪(TOC-VCPH, TNM-1),有机氮含量(mg/L) = 总氮 − 无机氮 − 菌体氮。
每24 h取样,利用pH计(雷磁PHS-3C)对降解液进行pH测量。
对菌株X3进行生长曲线测定,其结果如图1所示,由细菌细胞生长密度OD600的变化可知,该菌在0~0.5 h处于适应期,0.5 h后进入对数生长期,12 h进入稳定生长期,2~8 h繁殖最快。
如图2所示,菌体氮含量与细菌浓度OD600具有良好的线性关系,其线性方程为y = 0.0503x − 0.0118,R值为0.9996,根据此线性方程可方便、快捷的计算菌体氮浓度。
图1. 菌株X3的生长曲线
图2. 菌体氮含量与细菌浓度(OD600)的线性关系
如图3所示,添加有机氮和无机氮的实验组中,氨氮含量呈先升高后降低的变化趋势,在48 h左右,氨氮达到最高浓度,较初始值增加了2.94倍,然后开始下降。原因可能是细菌X3利用有机氮源,将其转化为氨氮,从而导致培养液中氨氮含量升高,而48 h后异养硝化作用使得氨氮浓度又开始下降;只添加无机氮的实验组,氨氮呈下降的变化趋势,在24 h内下降趋势最为明显,72 h后下降趋势减缓,96 h降解率为77.58%;两个实验组中的空白对照无明显变化。
亚硝酸氮在两个实验组中的变化趋势完全不同,具体见图4,添加有机氮和无机氮的实验组氨氮在24 h内变化不明显,24 h后明显上升,在第4天达到最高值,较初始值增加了10.66%,其后开始缓慢下降;只添加无机氮的实验组亚硝酸氮在24 h内明显上升,其后下降,96h降解率为39.64%,其后下降趋势减慢。
硝酸氮的变化趋势见图5,添加有机氮和无机氮的实验组,24 h硝酸氮无明显变化,其后开始下降,48 h达到最低,降解率为27.99%,之后开始升高,96 h降解率为12.57%;只添加无机氮的实验组硝酸氮持续下降,96 h降解率达74.42%。
无机氮含量变化与氨氮基本一致,具体见图6。由以上结果可以看出,在有机氮存在的情况下,异养硝化和好氧反硝化反应均有一定程度的延迟,且降解效率也受影响。
图3. 细菌X3对氨氮的降解实验结果
图4. 细菌X3对亚硝酸氮的降解实验结果
图5. 细菌X3对硝酸氮的降解实验结果
图6. 细菌X3对无机氮的降解结果
如图7所示,细菌X3对有机氮的降解在48 h内最为明显,呈明显下降趋势,降解率达48.76%;其后有机氮浓度略有回升,但变化幅度很小;对照组的有机氮无明显变化。由此可以推断,异养硝化–好氧反硝化细菌X3对降解液中的有机氮降解主要在48 h以内,48 h后其降解效果不明显,可能转为利用其它形态的氮源。
结合无机氮和有机氮降解实验结果,可以看出,细菌X3在几种形态氮都存在的情况下,优先利用的是有机氮,然后是无机氮。
如图8所示,两组实验中,总氮含量均呈明显下降变化趋势,空白对照无明显变化。由此可推测,细菌X3可以将溶解态氮转化为气体将其去除,从而使降解液中的总氮含量下降;添加有机氮和无机氮的实验组96 h总氮去除率为17.07%,最高去除率为32.90%;只添加无机氮的实验组96 h总氮去除率为
图7. 细菌X3对有机氮的降解实验结果
图8. 细菌X3对总氮的降解实验结果
51.13%,最高去除率为53.33%。
实验期间两组空白对照中的pH无变化,添加有机氮和无机氮的实验组pH呈先升高后降低的变化趋势,在48 h时pH达到最高值,其后pH开始下降,这个结果与该组中实验初始阶段氨氮浓度上升的结果起到相互验证的作用。未添加有机氮的实验组pH呈下降的变化趋势。见表1。
实验组 时间 | 初始 | 第2天 | 第4天 | 第7天 | 第14天 |
---|---|---|---|---|---|
X3-1 | 8.10 ± 0.11 | 8.48 ± 0.20 | 8.12 ± 0.16 | 7.85 ± 0.15 | 7.59 ± 0.22 |
X3-2 | 8.10 ± 0.11 | 8.09 ± 0.20 | 8.02 ± 0.16 | 8.05 ± 0.15 | 8.04 ± 0.22 |
C-1 | 8.10 ± 0 | 8.10 ± 0 | 8.10 ± 0 | 8.10 ± 0 | 8.10 ± 0 |
C-2 | 8.10 ± 0 | 8.10 ± 0 | 8.10 ± 0 | 8.10 ± 0 | 8.10 ± 0.05 |
表1. 降解液中pH变化
孙雪梅等 [
研究表明 [
有报道表明 [
国家自然科学基金课题(31170113)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(20603022013019)共同资助。
张 艳,成 钰,费聿涛,李秋芬. 异养硝化–好氧反硝化细菌X3的氮形态响应 Response to Different Nitrogen Forms of Heterotrophic Nitrifying-Aerobic Denitrifying Bacteria X3[J]. 海洋科学前沿, 2016, 03(04): 118-126. http://dx.doi.org/10.12677/AMS.2016.34016