目的:探讨药对百部–紫菀平喘作用机制并探索配伍比例对药对的药效作用影响。方法:建立SD大鼠咳嗽变异性哮喘(CVA)模型,灌胃百部–紫菀不同配伍比例提取物,采用Elisa方法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-4,INF-γ,IL-17及IL-10含量,并测定BALF中的炎性细胞变化,比较组间差异。结果:药对百部-紫菀给药后,CVA大鼠Thl/Th2及Th17/Treg水平失衡均得到部分纠正,同时嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞水平明显降低,统计学显示具有显著性差异。配伍比例对药效的作用具有一定程度的影响,配伍1:1时的药效作用最强。结论:药对百部–紫菀对CVA大鼠的平喘机制与纠正Thl/Th2与Th17/Treg细胞平衡,减轻炎性细胞浸润有关,配伍比例对药对的药效作用具有一定程度的影响。 Objective: To study the antiasthma mechanism of couplet medicine Baibu-Ziwan and investigate the pharmacodynamic effects on the proportion compatibility. Method: Cough variant asthma (CVA) rats were established and orally administrated by the extractions of Baibu-Ziwan with dif-ferent compatibility. The IL-4, INF-γ, IL-17 and IL-10 levels in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined by Elisa method and the numbers of inflammatory cells in BALF changes in lung were measured, respectively. The differences were tested among the groups by SPSS 19.0 software. Results: The levels of Thl/Th2 and Th17/Treg were both corrected after administration of the extractions of Baibu-Ziwan with inflammatory cells (eosinophil, lymphocytes and neutrophil) decreased in CVA group (p < 0.05). Conclusion: The antiasthma mechanism of couplet medicine Baibu-Ziwan on CVA rats may be related to the regulating imbalance of Thl/Th2 and Th17/Treg and the decreased infiltration of inflammatory cells, and the proportion compatibility had some influences on its pharmacodynamic effects.
姜登钊1,李辉敏2,刘可越1
1九江学院药学与生命科学学院,江西省系统生物医学重点实验室,江西 九江
2九江学院基础医学院,江西 九江
收稿日期:2017年1月20日;录用日期:2017年2月2日;发布日期:2017年2月7日
目的:探讨药对百部–紫菀平喘作用机制并探索配伍比例对药效的作用影响。方法:建立SD大鼠咳嗽变异性哮喘(CVA)模型,灌胃百部–紫菀不同配伍比例提取物,采用Elisa方法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-4,INF-γ,IL-17及IL-10含量,并测定BALF中的炎性细胞变化,比较组间差异。结果:药对百部-紫菀给药后,CVA大鼠Thl/Th2及Th17/Treg水平失衡均得到部分纠正,同时嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞水平明显降低,统计学显示具有显著性差异。配伍比例对药对的药效作用具有一定程度的影响,配伍1:1时的药效作用最强。结论:药对百部–紫菀对CVA大鼠的平喘机制与纠正Thl/Th2与Th17/Treg细胞平衡,减轻炎性细胞浸润有关,配伍比例对药对的药效作用具有一定程度的影响。
关键词 :药对,百部–紫菀,变异性哮喘,配伍,细胞因子
Copyright © 2017 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma, CVA)是支气管哮喘的一种特殊类型,以慢性持续性干咳为主要临床表现。目前的研究表明CVA是典型哮喘的前体阶段,大约1/3-1/2CVA患者最终会发展为典型哮喘,严重危害人们的健康 [
SPF级雄性SD大鼠70只,体重200~260 g,购自湖北省实验动物研究中心(SCXK(鄂)2008-0005)。
百部,紫菀均购自于九江市开心人大药房,经九江学院高春华教授分别鉴定为对叶百部Stemona tuberosa Lour.,紫菀Aster tataricus L.f.。两味药材粉碎后分别按比例(1:0, 0:1, 1:1, 1:2, 2:1)经过蒸馏水浸泡0.5 h后,煮沸提取,第一次提取1 h,第二次提取0.5 h,合并两次的提取液,提取液水浴浓缩至原生药量含量为3.6 g/ml。氢氧化铝为天津市科密欧化学试剂有限公司产品,以去离子水制成10%佐剂;卵蛋白(OVA)为美国Sigma公司产品,用去离子水配成1%浓度的使用液,溶入10%佐剂,制成浓度为1 mg/mL的溶液。细胞因子IL-4,INF-γ,IL-17,IL-10检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。
健康SD大鼠经过3天适应后,以新配制的卵蛋白皮下注射,分别在两后足跖、腹股沟、腰、背、颈部共取10处,每处皮下注射0.05 mL,同时腹腔注射0.5 mL,合计1 mL,1周后重复1次,加强致敏效果。造模大鼠第15天置于4 L的玻璃罩内,以400 mmHg的超声雾化恒压喷入1%的卵蛋白溶液20 min激发大鼠哮喘,以大鼠腹肌出现明显收缩,并出现呼吸加深、加快等呼吸道痉挛症状,提示造模成功 [
随机分为7组,分别为正常对照组,模型组,百部组,紫菀组,百部–紫菀(1:1)组,百部–紫菀(1:2)组,百部–紫菀(2:1)组,每组10只。百部组,紫菀组给药浓度为18 g生药/kg(相当于成人临床用量20倍),百部–紫菀药对各组给药浓度为36 g生药/kg (相当于成人临床用量20倍),每天一次;正常对照组、模型对照组以蒸馏水灌胃,每天一次。
大鼠造模成功后,各实验组大鼠按实验剂量给药,实验第14天处死大鼠,剪开颈部皮肤,于气管正中处剪开小口,插入气管套管,以磷酸盐缓冲溶液行支气管肺泡灌洗,来回冲洗3次,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。涡旋混合混匀BALF,取50 μl加入等量的白细胞计数液,以细胞计数板计数炎性细胞。剩余灌洗液冷冻离心,3000 r/min离心10 min,取上清液,−80℃冰箱低温保存。
观察实验期间各组大鼠的呼吸频率、精神、饮食、活动、毛发、大小便等一般情况。
采用酶联免疫吸附法进行测定相关细胞因子水平,具体操作按照试剂盒说明书进行。
采用SPSS19.0统计软件进行分析,数据以均数 ± 标准偏差(
正常组大鼠反应正常,体重均有所增长(平均增重约15%),其他未见异常情况,模型组大鼠经抗原激发后出现躁动不安,打喷嚏,呼吸急促,饮水量增多,食量减少,反应迟钝,活动明显减少,毛色发黄并且掉毛,体重减轻(平均减重约10%)。百部组大鼠症状较模型组较好,活动、反应、饮食与正常组相仿,体重有所增长;而紫菀组大鼠仍具有部分模型组大鼠症状,活动较少,呼吸急促,体重减轻。百部–紫菀药对各组大鼠的上述症状明显好于模型组及紫菀组,活动、反应、饮食与正常组几乎无差异,体重有所增长(平均增重约10%)。
各实验组大鼠炎性细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数见表1。模型对照组大鼠BALF中炎性细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数较正常对照组明显升高,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05);百部组,紫菀组,百部–紫菀(1:1)、百部–紫菀(1:2),百部–紫菀(2:1)组大鼠BALF中炎性细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数均较模型对照组明显降低,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05);百部–紫菀药对各给药组间差异并不具有统计学意义(p > 0.05),但各药对组与单味药组相比炎性细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数均显著降低,差异均具有统计学意义(p < 0.05)。
各实验组大鼠BALF中细胞因子INF-γ,IL-4,IL-17,IL-10水平见表2。与空白对照组相比,模型对照组大鼠BALF中INF-γ,IL-10水平明显降低,IL-4,IL-17水平明显升高,INF-γ/IL-4比值明显降低,
组别 | 炎性细胞总数 | 嗜酸性粒细胞 | 淋巴细胞 | 中性粒细胞 |
---|---|---|---|---|
空白对照组 | 10.12 ± 3.52 | 1.34 ± 0.62 | 1.28 ± 0.34 | 0.24 ± 0.13 |
模型组 | 38.43 ± 6.06a | 5.94 ±0.78a | 3.45 ± 0.53a | 1.42 ± 0.33a |
百部组 | 25.63 ± 5.24ab | 3.47 ±0.81ab | 2.65 ± 0.56ab | 1.01 ± 0.37ab |
紫菀组 | 26. 32± 5.39ab | 3.94 ± 0.68ab | 2.68 ± 0.61ab | 1.12 ± 0.43ab |
百部–紫菀药对组(1:1) | 16.75 ± 4.81abcd | 2.34 ± 0.58 abcd | 2.25 ± 0.57 abcd | 0.48 ± 0.18 abcd |
百部–紫菀药对组(1:2) | 18.85 ± 3.23 abcd | 2.84 ± 0.89 abcd | 2.32 ± 0.84 abcd | 0.54 ± 0.24 abcd |
百部–紫菀药对组(2:1) | 17.15 ± 4.54 abcd | 2.32 ± 0.75 abcd | 2.16 ± 0.27 abcd | 0.67 ± 0.25 abcd |
表1. 各实验组大鼠炎性细胞总数和嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数(×106/L,
注:与空白对照组比较 a p < 0.05;与模型组比较b p < 0.05;与百部组比较c p < 0.05;与紫菀组比较d p < 0.05。
组别 | INF-γ | IL-4 | IL-17 | IL-10 | INF-γ/IL-4 | IL-17/IL-10 |
---|---|---|---|---|---|---|
空白对照组 | 24.76 ± 0.50 | 12.01 ± 0.61 | 20.16 ± 1.25 | 25.35 ± 1.56 | 2.06 ± 0.094 | 0.79 ± 0.11 |
模型组 | 14.40 ± 0.85a | 27.60 ± 0.80a | 32.57 ± 3.45a | 12.60 ± 0.97a | 0.52 ± 0.041a | 2.58 ± 0.23a |
百部组 | 17.25 ± 1.12b | 23.03 ± 0.76b | 27.32 ± 1.18b | 14.07 ± 1.13b | 0.75 ± 0.036b | 1.94 ± 0.17b |
紫菀组 | 17.28 ± 1.18b | 24.13 ± 0.82b | 26.21 ± 1.35b | 13.69 ± 1.83b | 0.72 ± 0.026b | 1.91 ± 0.14b |
百部–紫菀药对组(1:1) | 21.42 ± 1.06bcde | 16.08 ± 0.73bcd | 23.48 ± 1.46bcdef | 21.07 ± 2.13bcdef | 1.33 ± 0.047bcde | 1.11 ± 0.12bcdef |
百部–紫菀药对组(1:2) | 18.85 ± 1.23b | 16.84 ± 0.89bcd | 26.34 ± 1.53b | 19.84 ± 1.79bcd | 1.12 ± 0.084bcd | 1.32 ± 0.13bcd |
百部–紫菀药对组(2:1) | 20.15 ± 1.54bcd | 16.32 ± 0.75bcd | 27.14 ± 1.84b | 17.38 ± 1.65bcd | 1.23 ± 0.057bcd | 1.56 ± 0.13bcd |
表2. 各实验组大鼠BALF中INF-γ,IL-4,IL-17,IL-10及INF-γ/IL-4,IL-17/IL-10水平(pg∙ml−1,
注:与空白对照组比较a p < 0.05;与模型组比较b p < 0.05;与百部组比较c p < 0.05;与紫菀组比较d p < 0.05;百部–紫菀药对组间比较(1:1与1:2) e p < 0.05,(1:1与2:1) f p < 0.05。
IL-17/IL-10比值明显升高,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05);与模型组比较,各组大鼠BALF中INF-γ,IL-10水平明显升高,IL-4,IL-17水平明显降低,INF-γ/IL-4比值明显升高,IL-17/IL-10比值明显降低,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05);各药对组与单味药组相比,INF-γ/IL-4比值明显升高,IL-17/IL-10比值明显降低,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05),说明配伍增强了药效作用;百部-紫菀药对各给药组间INF-γ/IL-4差异并不具有统计学意义(p > 0.05),配伍1:1组药效作用最强,但给药组间IL-17/IL-10差异具有统计学意义(p < 0.05),配伍1:1组药效作用最强,说明配伍比例对于Th17/Treg细胞因子平衡具有一定的影响。
哮喘是由多种炎性细胞、细胞因子和炎性介质共同参与的气道慢性非特异性炎性疾病,其关键的效应细胞是嗜酸性粒细胞和Th细胞 [
百部–紫菀药对是止嗽散复方的核心配伍,而复方配伍比例对于复方药效作用具有重要的影响 [
国家自然科学基金项目(81560642);江西省自然科学基金项目(20142BAB205081)。
姜登钊,李辉敏,刘可越. 不同配比组方的百部–紫菀药对咳嗽变异性哮喘大鼠Th1/Th2及Th17/Treg细胞因子平衡影响 Study on the Effects of Couplet Medicine Baibu-Ziwan with Different Proportions on Cytokines Level of Type Th1/Th2 and Th17/Treg in Cough Variant Asthma Rats[J]. 药物资讯, 2017, 06(01): 6-11. http://dx.doi.org/10.12677/PI.2017.61002