选择天然草甸草地及开垦农田后7年和50年样地,采用IlluminaMiSeq高通量测序的方法研究了草甸草地利用方式改变后,土壤细菌群落结构的变化特征及与土壤理化性质的关系。结果表明,天然草地开垦农田对土壤理化性质有显著影响,有机质和全N含量迅速下降,电导率提高。Proteobacteria,Acidobacteria,Actinobacteria,Bacteroidetes,Chloroflexi,Gemmatimonadetes,Firmicutes,Planctomycetes,Verrucomicrobia,Thaumarchaeota和Nitrospirae是本地区的优势菌群。草地利用方式改变对土壤细菌群落结构有显著影响,引起优势菌群相对优势度改变,但对物种组成没有显著影响。土壤理化性质对细菌群落结构的形成有重要作用。 To investigate how soil bacterial communities respond to the change during conversion from natural meadow grassland to farmland, and the relationship between bacterial community and soil properties, we detected the shifts in diversities and compositions of soil bacterial communities as well as the relative abundance of dominant bacterial taxa with the high throughput IlluminaMiSeq sequencing technique from natural grassland, 7-yr farmland, and 50-yr farmland in Horqin Sandy Land. We found that land-use change resulted in the significant changes in soil physical and chemical properties with the distinct decreases in soil organic matter and total N contents and the increase in soil conductivity. Soil bacterial community structure was affected by land-use change, with the significant change in relative abundance of dominant bacterial populations. However, species composition of bacterial community remained unchanged. Soil properties had important effects on the structure of soil bacterial community. Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Firmicutes, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Thau- marchaeota, and Nitrospirae were the dominant taxa in the Horqin area.
刘静,陈梦婷,任和,景年龙,于广洋,曹成有*
东北大学生命科学与健康学院,辽宁 沈阳
收稿日期:2017年5月4日;录用日期:2017年5月21日;发布日期:2017年5月26日
选择天然草甸草地及开垦农田后7年和50年样地,采用IlluminaMiSeq高通量测序的方法研究了草甸草地利用方式改变后,土壤细菌群落结构的变化特征及与土壤理化性质的关系。结果表明,天然草地开垦农田对土壤理化性质有显著影响,有机质和全N含量迅速下降,电导率提高。Proteobacteria,Acidobacteria,Actinobacteria,Bacteroidetes,Chloroflexi,Gemmatimonadetes,Firmicutes,Planctomycetes,Verrucomicrobia,Thaumarchaeota和Nitrospirae是本地区的优势菌群。草地利用方式改变对土壤细菌群落结构有显著影响,引起优势菌群相对优势度改变,但对物种组成没有显著影响。土壤理化性质对细菌群落结构的形成有重要作用。
关键词 :科尔沁沙地,土壤细菌,群落结构,高通量测序
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土壤微生物是陆地生态系统中最活跃的成分,担负着分解动、植物残体的重要使命,推动着土壤的物质转化和能量流动。微生物对生存的微坏境十分敏感,土壤微生物多样性代表着微生物群落的稳定性,是土壤生态机制及土壤胁迫对微生物群落影响的反映指标,可作为土壤生态系统变化的预警指标 [
近几十年来,我国有600万hm2天然草地被开垦为农田 [
研究区位于科尔沁沙地西部翁牛特旗乌兰敖都地区(430 02'N,1190 39'E)。地形属于河湖相冲积盆地,这里沙地起伏,坨甸相间,为广阔的沙地景观,沙地和甸子地呈东西排列。该地区属温带大陆性半干旱气候,气候干燥,风沙大且频繁。年均风速4.5 m∙s−1,每年起风沙日数200天以上。年平均降水340.5 mm,多集中在7~8月,年蒸发量2500 mm左右。年平均温度6.4℃,无霜期130多天。其原生植被属于森林向草原的过渡类型,为蒙古植物区系、华北植物区系和长白植物区系的交接地带,其中分布最广、种类最多的是蒙古植物区系植物。目前原生植被已被破坏殆尽,大部分已演变为沙生植被和草甸植被。草甸植被一般分布于丘间低地和连片甸子地上,由于土壤和水分条件相对较好,植物种类较为丰富,生物量较高,在生产中常常作为基本打草场使用,同时也做为冬季和早春放牧场。每年4~10月围封禁牧,打完牧草后10月~次年4月进行冬季放牧。但随着人口和牲畜数量的迅速膨胀,对打草场的利用强度不断增强,大面积打草场被开垦为农田。草场内土壤类型主要有碱化草甸土、盐土和碱土等。
样品在中国科学院应用生态研究所乌兰敖都荒漠化试验站固定试验地内采集。选择天然草甸草地(打草场)、毗邻的开垦7年农田和开垦50年农田为研究对象。每种土地利用方式分别设20 m × 20 m样地3个(3次重复),每个样地随机布设20个取样点,分别采集0~10 cm的土壤样品。每个样地土壤样品分成2份,一份风干后用于测定理化性质,另一份装于密闭自封袋,取回后于−80℃冰箱保存,用于DNA提取。
土壤有机质采用重铬酸钾氧化法测定;全N采用半微量凯氏定N法;速效N采用碱解扩散法测定;全P采用钼锑抗比色法;有效P采用NaHCO3提取法;土壤水分含量采用烘干法;pH和电导率分别采用pH计和电导仪测定 [
取0.3 g新鲜土壤,用DNA提取试剂盒(天根)提取土壤总DNA。采用带条码引物341F和805R扩增16S rRNA基因。PCR反应液(50 μL)组成是:10 × buffer 5 μL,模板DNA 10 ng,dNTP (10 mM) 0.5 μL,341F和805R引物(50 μM)各0.5 μL,Taq酶(5 U∙μL−1) 0.5 μL,加去离子水补足体积。热循环程序如下:94℃ 3 min;94℃ 30 s,45℃ 20 s,72℃ 30 s,共5个循环;94℃ 20 s,55℃ 20 s,72℃ 30 s,共20个循环;最后,72℃延伸10 min。按照说明书,采用琼脂糖回收试剂盒纯化PCR产物,回收产物用Qubit 2.0定量。使用QIIME(9.1)软件分析原始序列,并进行质量过滤。去除长度小于200 bp、平均质量分数 < 25和嵌合体后,最后得到的序列用于OTU分析。采用UPARSE软件(7.1)对序列进行聚类(序列相似性设为97%),然后用RDP classifier (Ribosomal Database Program)贝叶斯算法对代表性OTU序列进行物种分类学分析 [
采用CANOCO 4.5软件分析土壤理化性质和细菌群落结构的关系,采用CanoDraw 4.0生成CCA分析图。
单因素方差分析表明,天然草地开垦为农田后,土壤理化性质发生了显著变化。土壤全氮、有机质、显著下降,电导率显著增加,而全P和速效N含量变化未达到显著水平(表1,P < 0.05)。经过一元线性回归分析,速效P含量与开垦时间呈现显著的线性关系(P < 0.05),表明速效P的含量随开垦时间呈现显著增加趋势。天然草地土壤有机质含量较高达到4.45%,而开垦7年后迅速下降,下降幅度达到46%。其主要原因是草地开垦农田后,土壤受到强烈扰动,土壤呼吸加剧,加速了有机质分解的进程。有机质含量的快速下降,也影响到其他全量和速效养分的变化。土壤电导率也表现出显著增加的趋势,说明草地开垦农田后会加剧土壤盐碱化进程。
通过对9个样品进行高通量测序,共获得66072个OUT,每个样品包含6114-7735个OUT (表2)。农田50年样地的OUT数量低于其他两个样地。采用Mothurs对ACE,Chao,and Shannon等α多样性指数进行了计算。其中天然草地ACE、Chao指数高于其他两个样地,其他指数在各样地之间未表现出明显差异。采用PCoA分析对样品间的相似性进行了比较(图1)。PCoA显示天然草地、7年农田和50年农田各自三个重复样品聚在一组,表明了不同样地之间微生物群落结构的差异。
采用RDP classifier对每个OUT的代表性序列进行物种分类学分析。测序结果共划分30个门,682个科,1197个属,1729个种。30个门中相对优势度>1%的主要包括:Proteobacteria,Acidobacteria,Actinobacteria,Bacteroidetes,Chloroflexi,Gemmatimonadetes,Firmicutes,Planctomycetes,Verrucomicrobia,Thaumarchaeota和Nitrospirae,占全部OTU的95.07%~97.16% (图2)。Proteobacteria和Acidobacteria在天然草地中占绝对优势,平均相对优势度分别为29.4%和31.8%。开垦为农田后这两个优势菌的相对优势度显著下降,7年农田为22.8%和18.8%,50年农田分别为21.3%和20.1%。Actinobacteria,Bacteroidetes,Chloroflexi,Gemmatimonadetes,Firmicutes和Planctomycetes的相对优势度则伴随着草地垦荒出现显著下降趋势。优势菌的显著变化对微生物群落的结构和功能将产生重要影响。
在属水平,草地开垦为农田也造成细菌群落结构发生一定的影响,主要体现优势属的相对优势度出现此消彼长的特点,但基本组成未发生变化,未出现新种出现和原有种消失的情况。如Blastocatella,Sphingomonas,Acidobacteria_bacterium和Chryseolinea在天然草地中的相对优势度分别为2.43%,2.50%,2.09%和1.00%,而在7年农田中则下降为1.95%,1.18%,0.60%和0.32%,在50年农田中分别为1.53%,1.67%,1.19%和0.30%。与此相反,一些在天然草地中相对优势度较低的属,开垦农田后优势度大幅度提高。如Pontibacter,Flavisolibacter,Adhaeribacter,Nocardioides和Massilia的相对优势度在天然草地中仅为0.17%~0.69%,而在7年农田和50年农田样地中分别提高到1.00%~3.65%和1.29%~2.18% (图3)。
采用CCA分析了土壤有机质、全N、全P、速效N、速效P、pH、含水率、电导率与土壤细菌微生物群落结构(属水平)的相互关系,结果见图4。图4表明,土壤理化性质与细菌群落结构有密切关系,其中土壤有机质和全N对天然草地影响最大,短期耕作(7年农田)受pH和电导率影响最大,而长期耕作条
指标 | 天然草地 | 7年农田 | 50年农田 | P | F |
---|---|---|---|---|---|
全N (g∙kg−1) | 0.085 ± 0.002c | 0.017 ± 0.007a | 0.058 ± 0.004b | 163.79 | <0.001 |
有机质(g∙kg−1) | 4.445 ± 1.072b | 2.068 ± 0.221a | 3.824 ± 0.588b | 8.850 | 0.016 |
全P (g∙kg−1) | 0.067 ± 0.005a | 0.030 ± 0.002a | 0.073 ± 0.033a | 4.351 | 0.068 |
速效P (mg∙g−1) | 5.314 ± 0.931a | 14.01 ± 1.986b | 28.34 ± 11.87c | 8.349 | 0.018 |
速效N (mg∙g−1) | 2.240 ± 0.285a | 2.402 ± 1.507a | 1.866 ± 1.090a | 0.192 | 0.830 |
含水量(%) | 13.11 ± 2.495a | 13.81 ± 0.934a | 13.25 ± 2.633a | 0.087 | 0.917 |
pH | 8.67 ± 0.200b | 8.74 ± 0.151c | 7.95 ± 0.128a | 17.831 | 0.003 |
电导率(µs∙cm−1) | 86.90 ± 6.329a | 350.2 ± 60.75c | 196.0 ± 53.88b | 23.735 | 0.001 |
表1. 不同样地土壤理化性质
三次重复的平均值,同一行不同小写字母表示差异显著。
样地 | Total OTUs | ACE | Chao | Shannon | Coverage |
---|---|---|---|---|---|
天然草地-1 | 7298 | 6600 | 6345 | 10.15 | 0.94 |
天然草地-2 | 7735 | 6695 | 6491 | 10.39 | 0.94 |
天然草地-3 | 7691 | 7259 | 6988 | 10.62 | 0.93 |
平均值 | 7575 | 6851 | 6608 | 10.39 | 0.94 |
农田7年-1 | 6926 | 6331 | 6152 | 10.60 | 0.95 |
农田7年-2 | 8466 | 6255 | 6147 | 10.69 | 0.95 |
农田7年-3 | 7616 | 6542 | 6353 | 10.60 | 0.94 |
平均值 | 7669 | 6376 | 6217 | 10.63 | 0.95 |
农田50年-1 | 6114 | 6499 | 6286 | 10.49 | 0.94 |
农田50年-2 | 6825 | 6438 | 6236 | 10.46 | 0.94 |
农田50年-3 | 7401 | 6726 | 6555 | 10.55 | 0.94 |
平均值 | 6780 | 6554 | 6359 | 10.50 | 0.94 |
表2. MiSeq测序结果和多样性估计
图1. 不同样地细菌群落结构的PCoA分析。M:天然草地;U7:7年农田;U50:50年农田(下同)
图2. 不同样地细菌优势门相对优势度
图3. 不同样地细菌优势属相对优势度
图4. 土壤细菌群落结构与环境因子的CCA分析
件下(50年农田)全P和速效P对细菌群落结构影响最大。根据CCA分析,也可以将所有样品分为三个簇,与PCoA的分析结果一致。
地面植被类型和土壤性质(如土壤类型、养分状况、含盐量、pH等)对微生物群落结构有显著影响 [
高通量测序及后续的物种分类学分析表明,天然草地开垦为农田后,不同样地的优势菌组成并未改变,但不同优势菌的相对优势度发生了此消彼长的特点。因此微生物群落结构的变化不表现为种类组成的差异,而主要体现在优势种群的数量比例变化上。Jangid等(2011)的研究表明 [
1) 科尔沁天然草地开垦为农田后,土壤理化性质发生显著变化,有机质和全N含量迅速下降,含盐量提高。
2) 天然草地开垦农田对土壤微生物群落结构有显著影响,主要体现在优势种群的数量变化上,而对物种组成没有明显影响。土壤理化性质对微生物群落结构的形成起重要作用。
3) Proteobacteria,Acidobacteria,Actinobacteria,Bacteroidetes,Chloroflexi,Gemmatimonadetes,Firmicutes,Planctomycetes,Verrucomicrobia,Thaumarchaeota和Nitrospirae是本地区的优势菌群。
国家重点研发计划项目(2016YFC0500803)。
刘静,陈梦婷,任和,景年龙,于广洋,曹成有. 科尔沁沙地草甸草地开垦农田对土壤细菌群落结构的影响Effect of Conversion from Natural Meadow Grassland to Farmland on the Structure of Soil Bacterial Community in Horqin Sandy Land[J]. 世界生态学, 2017, 06(02): 69-76. http://dx.doi.org/10.12677/IJE.2017.62008