制备不同多巴胺反应浓度的透明质酸水凝胶,研究其对内皮细胞粘附行为、增殖能力与活性的影响。通过紫外可见光谱(UVVis)检测透明质酸与多巴胺反应后是否有酚羟基特征吸收峰,通过扫描电镜观察水凝胶的断面形貌,通过溶胀平衡法测试水凝胶的溶胀率,通过荧光染色法和CCK-8细胞增殖活性检测手段对HA-DAP (HA:透明质酸,DAP:多巴胺)水凝胶表面内皮细胞生长行为进行评价。结果显示,成功制备出不同多巴胺反应浓度的透明质酸水凝胶,透明质酸水凝胶的孔洞直径在30~120 μm,随着多巴胺浓度增加,凝胶孔洞直径呈减小趋势。同时,多巴胺反应浓度为3 mg/ml的透明质酸水凝胶的细胞相容性(内皮细胞粘附,内皮细胞静态培养1天、3天数量、形态和活性)优于其他样品。 The ideal biomaterials surface for vascular contacting should be endothelialization ability. To im-prove the inducing endothelialization ability of material surface, this research focuses on a new technique of hyaluronic acid-dopamine (HA-PDA) hydrogel. Several bio-functional HA-PAD hydrogel made of dopamine and hyaluronic acid in different ratios were fabricated. The catechol was determined by ultraviolet-visible (UVVis) spectroscopy at 280 nm. The cross-sectional morphology of the hydrogels was observed by scanning electron microscopy (SEM), and the swelling rate of the hydrogels was measured by the swelling equilibrium method. The morphology and quantity of cells on the surface were detected by rhodamine staining and CCK-8. The results showed that the HA-DAP hydrogel made of dopamine and hyaluronic acid in different ratios was successfully constructed. The pore size of HA-DAP hydrogel was 30 - 120 μm, and the pore size of hydrogel decreased with the increase of dopamine concentration. HA-DAP3 (hyaluronic acid: 10 mg/ml, dopamine: 3 mg/ml) provided favorable cell compatibility according to the endothelial cells adhesion, proliferation and its biological activity based the CCK-8 measurements. We hope that HA-DAP hydrogel can provide more helpful exploration and application for promoting endothelialization on cardiovascular stents.
许方亭,崔园园,陈俊英*,黄楠
西南交通大学材料学院材料先进技术教育部重点实验室,四川 成都
收稿日期:2017年5月5日;录用日期:2017年5月23日;发布日期:2017年5月26日
制备不同多巴胺反应浓度的透明质酸水凝胶,研究其对内皮细胞粘附行为、增殖能力与活性的影响。通过紫外可见光谱(UVVis)检测透明质酸与多巴胺反应后是否有酚羟基特征吸收峰,通过扫描电镜观察水凝胶的断面形貌,通过溶胀平衡法测试水凝胶的溶胀率,通过荧光染色法和CCK-8细胞增殖活性检测手段对HA-DAP (HA:透明质酸,DAP:多巴胺)水凝胶表面内皮细胞生长行为进行评价。结果显示,成功制备出不同多巴胺反应浓度的透明质酸水凝胶,透明质酸水凝胶的孔洞直径在30~120 μm,随着多巴胺浓度增加,凝胶孔洞直径呈减小趋势。同时,多巴胺反应浓度为3 mg/ml的透明质酸水凝胶的细胞相容性(内皮细胞粘附,内皮细胞静态培养1天、3天数量、形态和活性)优于其他样品。
关键词 :水凝胶,透明质酸,内皮细胞
Copyright © 2017 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
目前,治疗心血管疾病的方法有冠脉搭桥手术、药物治疗术和介入治疗。其中,介入治疗由于创伤小,成为治疗心血管疾病的主要方法 [
近年来,材料表面细胞外基质等微环境因素模拟被认为是加速表面内皮化的有效方法。水凝胶在结构上与细胞外基质相似,有利于微环境构建 [
但是关于不同多巴胺浓度制成的透明质酸水凝胶对内皮细胞的研究较少,本文研究了不同多巴胺浓度制成的透明质酸水凝胶的细胞相容性的差异。
透明质酸(hyaluronic acid, 500 KDa),多巴胺(Dopamine, Sigma),氢氧化纳(NaoH, 0.1 mol/ml),盐酸(HCl, 0.1 mol/ml),高碘酸钠(NaIO4),罗丹明123,DMEM-F12培养基,胎牛血清,0.25%胰酶,0.9%氯化钠注射液,细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK-8),内皮细胞(内皮细胞株Eahy926),扫描电镜(SEM,Philips Quanta 200),荧光显微镜(OLYMPUS-IX51,日本),超净工作台,CO2细胞培养箱,高压灭菌锅,电热恒温水浴锅,移液枪,酶标仪等。
首先将0.1 g透明质酸溶解到10 ml去离子水中(透明质酸浓度为10 mg/ml),用搅拌子搅拌两小时,使透明质酸完全溶解。加入一定量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。用0.1 mol/ml的盐酸调节PH值到4.0~6.0之间,然后分别在1 ml的透明质酸溶液中加入3 mg、4 mg、5 mg、6 mg多巴胺(DAP),反应9~10小时后,使多巴胺上的氨基与透明质酸上的羧基发生反应,通过酰胺键将多巴胺接枝到透明质酸上,最后将所得的溶液放−4℃冰箱保存,得到HA-DAP衍生物。
将上述2.2.1得到的HA-DAP衍生物从冰箱中取出恢复到室温,分别用0.1 mol/ml的氢氧化钠溶液调节反应溶液的PH值到9.0。再向各样品中加入NaIO4,使多巴胺上的酚羟基氧化为醌基交联到透明质酸上,形成水凝胶。3 mg、4 mg、5 mg、6 mg多巴胺(DAP)对应的样品分别标记为HA-DAP3,HA-DAP4,HA-DAP5,HA-DAP6。
采用紫外可见光谱(UVVis)检测透明质酸与多巴胺反应后样品表面是否有多巴胺的特征吸收峰;用扫描电镜(SEM)观察HA-DAP水凝胶的断面形貌;通过溶胀平衡法测试水凝胶的溶胀率;通过荧光染色法和CCK-8细胞增殖活性检测手段对改性表面的内皮细胞生长行为进行评价。
如2.2.2所述,所制备的每种样品的平行样分别设置为三个。将水凝胶完全浸泡在PBS中溶胀至平衡,用滤纸擦干凝胶表面的水,称量其质量记为mw。然后将溶胀的水凝胶放入真空干燥箱中至质量不再变化,称量其质量记为mi。根据下式(1)得到各样品的溶胀率。
将已经长满的内皮细胞,用生理盐水清洗3遍。用巴氏吸管将残余的NaCl吸尽,然后向培养瓶中加入3~4滴胰酶,使内皮细胞充分消化下来后,再向细胞培养瓶中加入3~5 ml已配好的细胞培养液。然后用巴士吸管吹打细胞悬液,使细胞均匀分布在细胞培养液中。加配置好的培养基,将细胞悬液稀释成4 × 104个/ml。然后,分别向样品中加入1 ml稀释后的细胞悬液,放入CO2孵箱,培养2小时后取出样品。用2.5%戊二醛固定12小时后进行荧光染色,最后于倒置荧光显微镜下观察粘附细胞的形态与数量。
同2.5方法,分别在两组平行样中种植内皮细胞。在孵箱中培养1天、3天,分别取出样品,在无菌条件下加入CCK-8(VCCK-8:V培养基) = 1:9进行细胞活性检测,然后将细胞悬液弃之,用2.5%戊二醛固定12小时后进行荧光染色,最后于倒置荧光显微镜下观察细胞形态、数量以及增殖情况。
由紫外图谱(图1)可以看到,经多巴胺修饰的透明质酸样品在280 nm有一个特征吸收峰。那是酚羟基的特征吸收峰,与文献报道相符 [
图2为HA-DAP水凝胶的宏观形貌图。透明质酸溶液是透明的,加入高碘酸钠后,溶液瞬间变成红褐色,且溶液逐渐变粘稠,一小时后,形成黑褐的水凝胶,如图2所示,凝胶的透光性较弱。将凝胶倒立,不掉落,可知水凝胶的粘着性较好。
图3为不同多巴胺含量HA-DAP水凝胶冷冻干燥后,其断面扫描电镜结果。凝胶内部呈规则的空间网络结构。其中大的孔洞直径在120 μm左右,小的孔洞直径在30 μm左右。水凝胶的孔洞直径随多巴胺浓度增加而减小。这可能是因为高的多巴胺浓度使交联度增高,使水凝胶的孔径直径减小。
从测试结果(表1)来看,其中多巴胺浓度较小时,溶胀率较高。而随着多巴胺浓度增加,溶胀率有下降的趋势。这主要是因为溶胀率与交联密度相关,当多巴胺浓度低时,水凝胶的交联密度小,这时形成的网络结构间距大,而能充分吸水。当多巴胺浓度大时,水凝胶交联密度大,形成的网络结构间距小,水凝胶吸收的水分较少。
图4为各样品表面内皮细胞粘附2小时荧光染色图。从图中可以看出,内皮细胞在各样品表面种植两个小时后,都有内皮细胞粘附,但内皮细胞数量有所不同。同时也可以看出,内皮细胞在水凝胶上培养两个小时后,几乎没有铺展开来。其中,多巴胺含量为3 mg/ml的HA-DAP水凝胶粘附的内皮细胞数量最多。
图5为内皮细胞静态培养1天、3天后的荧光染色结果图,从图中可以看出,内皮细胞静态培养1天时,细胞在水凝胶表面铺展不明显,各样品表面细胞的数量差距不明显。内皮细胞静态培养3天后,细胞在各样品表面均出现不同程度铺展,其中含低浓度多巴胺的透明质酸水凝胶更有利于内皮细胞的铺展,并且低浓度多巴胺含量的透明质酸水凝胶更有利于内皮细胞增殖。这可能是高浓度多巴胺对细胞有一定的毒性 [
从内皮细胞CCK-8检测结果(图6)可以看出,内皮细胞静态培养1天后,各凝胶表面细胞活性差异
图1. HA-DAP紫外图谱检测结果
图2. (a) 透明质酸溶液,(b) HA-DAP水凝胶的宏观形貌图
图3. 不同多巴胺含量HA-DAP水凝胶断面扫描电镜图
图4. 各样品表面内皮细胞粘附2小时荧光染色图
图5. 内皮细胞静态培养1天、3天后的荧光染色结果图
图6. 内皮细胞静态培养1天、3天后的CCK-8结果图
样品号 | HA-DAP3 | HA-DAP4 | HA-DAP5 | HA-DAP6 |
---|---|---|---|---|
溶胀度 | 21.87% | 37.04% | 20.58% | 18.34% |
表1. 不同多巴胺浓度HA-DAP水凝胶的溶胀率
不大。而内皮细胞静态培养3天后,各凝胶表面细胞活性有明显差别。其中样品HA-DAP3更有利于内皮细胞增殖,这与荧光染色结果相一致。多巴胺反应浓度低的透明质酸水凝胶细胞相容性优于其他样品。
透明质酸是一种分布在多种组织细胞外基质的蛋白多糖,能够与干细胞表面受体相互作用,并能促进干细胞的增殖、迁移和分化 [
随着反应多巴胺浓度的减小,透明质酸水凝胶孔洞直径呈增大的趋势(图3),溶胀度也增加(表1)。这可能是多巴胺浓度低时交联度也较小,水凝胶的孔径直径较大,能够充分吸水。从内皮细胞粘附(图4)和内皮细胞静态培养1天、3天结果(图5和图6)来看,反应浓度为3 mg/ml的HA-DAP水凝胶细胞相容性更好。这可能是高浓度多巴胺具有一定的细胞毒性,因此HA-DAP6水凝胶细胞相容性(数量、形态和活性)较差。
1) 成功制备出不同多巴胺反应浓度的HA-DAP水凝胶。
2) 随着多巴胺浓度的增加,透明质酸水凝胶孔洞直径呈减小趋势。
3) 多巴胺浓度为3 mg/ml时,透明质酸水凝胶表现出良好的内皮细胞相容性(数量、形态和活性)。
国家自然科学基金项目(31470921)。
许方亭,崔园园,陈俊英,黄 楠. HA-DAP水凝胶的制备及其对内皮细胞生物学行为的影响Preparation and Its Influence of HA-DAP Hydrogel on the Biological Behavior of the Endothelial Cells[J]. 材料科学, 2017, 07(03): 323-330. http://dx.doi.org/10.12677/MS.2017.73044