目的:观察中药对异动症(levodopa-induced dyskinesias, LID)大鼠行为学和纹状体多巴胺D1受体活性及mRNA表达的影响。方法:6-OHDA构建(Parkinson’s disease, PD)大鼠模型,左旋多巴治疗4周制作LID大鼠模型,将成功建立的LID大鼠,随机分为模型组、中药干预组,另取相同数量的正常大鼠作为正常对照组,治疗四周后观察中药对LID大鼠异常不自主运动(abnormal involuntary move-ment, AIM)评分、剂峰旋转次数的影响;测定大鼠纹状体多巴胺D1受体的最大结合容量(maximum binding capacity, Bmax)和平衡解离常数(equilibrium dissociation constant, KD);运用实时定量PCR检测多巴胺D1受体mRNA表达。结果:模型组大鼠随着左旋多巴治疗时间的延长,AIM评分及剂峰旋转次数进行性升高;与模型组比较,中药干预后可明显减少异动症大鼠的AIM积分及旋转次数(P < 0.05)。纹状体多巴胺D1受体活性结果显示:两组大鼠与正常对照组比较Bmax升高(P < 0.01),KD值降低(P < 0.05),受体活性明显增高,中药治疗可使Bmax降低,KD值升高(P < 0.01),明显降低D1受体活性;荧光实时定量PCR结果显示模型组大鼠多巴胺D1受体mRNA表达明显上调(P < 0.01);中药可以显著下调多巴胺D1受体mRNA的表达(P < 0.05)。结论:多巴胺D1受体介导的直接通路过度激活可能是异动症产生的主要机制。中药主要是通过下调多巴胺D1受体活性及基因表达从而有效缓解异动症症状。 Objective: To observe the effects of Traditional Chinese Medicine on neurobehavioral manifestations and the activity and mRNA expression of striatal dopamine D1 receptors of rats with levodo-pa-induced dyskinesias (LID). Methods: The rat model of Parkinson’s disease (PD) was established by 6-OHDA; then, the model of LID in rat was produced by injecting levodopa (LD) and benserazide for 4 weeks. The rats were divided into normal control group, LID model group and TCM interven-tion group. After 4 weeks of treatment, the effect of TCM on abnormal involuntary movement (AIM) score of rats with LID, peak dose rotation and efficacy time of levodopa (LD) were observed. The maximum binding capacity (Bmax) and equilibrium dissociation constant (KD) of striatal dopamine D1 receptors of rats were determined. The mRNA expression of dopamine D1 receptors was assayed by using real-time fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR). Result: With the extension of LD treat-ment time, the AIM score and peak dose rotation of rats in the LID model group increased progres-sively. Comparing to the LD model group, TCM intervention could obviously reduce the AIM score and peak dose rotation of rats with LID (P < 0.05). The research of D1 receptor activity showed that level of Bmax increased (P < 0.01) and level of KD reduced (P < 0.01) in the LID model group and the TCM intervention group in comparison to those in the normal control group. The activity of D1 receptor increased obviously. TCM treatment could decrease the Bmax level, increase the KD level (P < 0.01) and lower the activity of D1 receptor. The results of FQ-PCR analysis revealed that the gene expression of D1 receptor was up-regulated in the LID model group (P < 0.01). TCM treatment can decrease over-expressed D1 receptor expression (P < 0.05). Conclusion: Over-activation in di-rect-pathway mediated by dopamine D1 receptor may be the main mechanism of LID. TCM effec-tively relieved LID symptoms through regulating the gene expression and activity of dopamine D1 receptors.
叶青1,高东雯2,周洁1,袁晓蕾1,袁灿兴1
1上海中医药大学附属龙华医院脑病科,上海
2上海中医药大学附属龙华医院超声科,上海
收稿日期:2017年5月11日;录用日期:2017年5月23日;发布日期:2017年5月26日
目的:观察中药对异动症(levodopa-induced dyskinesias, LID)大鼠行为学和纹状体多巴胺D1受体活性及mRNA表达的影响。方法:6-OHDA构建(Parkinson’s disease, PD)大鼠模型,左旋多巴治疗4周制作LID大鼠模型,将成功建立的LID大鼠,随机分为模型组、中药干预组,另取相同数量的正常大鼠作为正常对照组,治疗四周后观察中药对LID大鼠异常不自主运动(abnormal involuntary movement, AIM)评分、剂峰旋转次数的影响;测定大鼠纹状体多巴胺D1受体的最大结合容量(maximum binding capacity, Bmax)和平衡解离常数(equilibrium dissociation constant, KD);运用实时定量PCR检测多巴胺D1受体mRNA表达。结果:模型组大鼠随着左旋多巴治疗时间的延长,AIM评分及剂峰旋转次数进行性升高;与模型组比较,中药干预后可明显减少异动症大鼠的AIM积分及旋转次数(P < 0.05)。纹状体多巴胺D1受体活性结果显示:两组大鼠与正常对照组比较Bmax升高(P < 0.01),KD值降低(P < 0.05),受体活性明显增高,中药治疗可使Bmax降低,KD值升高(P < 0.01),明显降低D1受体活性;荧光实时定量PCR结果显示模型组大鼠多巴胺D1受体mRNA表达明显上调(P < 0.01);中药可以显著下调多巴胺D1受体mRNA的表达(P < 0.05)。结论:多巴胺D1受体介导的直接通路过度激活可能是异动症产生的主要机制。中药主要是通过下调多巴胺D1受体活性及基因表达从而有效缓解异动症症状。
关键词 :异动症大鼠,滋肾平颤颗粒,行为学,多巴胺D1受体,直接通路
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帕金森病是中老年人常见的慢性进展性神经系统变性疾病,其主要病理特点是黑质致密部多巴胺(DA)能神经元变性。目前,左旋多巴(levodopa, LD)仍是改善帕金森病症状的金标准药物,但长期应用(一般大于5年)后50%以上的患者会出现异动症 [
滋肾平颤颗粒(熟地黄15 g、枸杞15 g、桑寄生20 g、天麻15 g、僵蚕10 g、莪术15 g、白芍药20 g、天南星15 g、全蝎3 g、蜈蚣3 g)由江苏天江药业有限公司分别制成免煎颗粒剂(批号:1410302),8 g/袋。左旋多巴粉剂(批号:SLD6438)和苄丝肼粉剂(批号:SL03323),购自美国Sigma公司。
实验动物成年雄性SD大鼠50只,体质量160~180 g,由上海中医药大学动物实验中心提供,动物许可证号为SCXK沪2014-0004。
6-hydroxydopamine (6-OHDA)、apomorphine (APO)、SCH23390、Spiperone,美国Sigma公司产品;3H-SCH23390 (比放射性69·8Ci/mmol)为美国Amersham公司产品;大鼠脑立体定位仪,68001型,深圳瑞沃德;冰冻离心机,Centrifuge 5417R,德国EPPENDORF公司;液体闪烁发光记数仪,Wallacl450型,美国PerkinElmer公司产品。IEppendorf核酸蛋白检测仪,德国Eppendorf。实时荧光定量PCR仪,7500fast,美国ABI;超低温冰箱,MDF-292,SANYO CO。
SPF级SD大鼠,麻醉后固定于大鼠脑立体定向仪上,参照大鼠脑立体定位图谱 [
PD大鼠予以左旋多巴腹腔注射治疗四周,注射剂量为20 mg/kg/d,bid。行为学测定AIM评分 > 20分则视为成功的LID模型 [
AIM评分方法 [
各组大鼠在治疗过程中于第7、14、21、28天上午用药后进行大鼠行为学观察和评分。剂峰旋转次数:注射左旋多巴后,每5 min记录旋转次数,最多的旋转次数为剂峰旋转次数。
42只大鼠造模后经行为学测试,成功造模的PD模型大鼠22只,LD治疗4周后,筛选出成功的LID大鼠模型16只,随机分为模型组、中药干预组每组8只,另取8只生理盐水造模大鼠为正常对照组。异动症模型组继续予以左旋多巴/苄丝肼腹腔注射,每日10 mg/kg,2次/d;中药干预组在模型组处理基础上给予中药灌胃(滋肾平颤颗粒24 g溶于100 ml生理盐水中),每次灌胃量为9 ml/kg,1次/d;正常对照组给予生理盐水灌胃及生理盐水腹腔注射,治疗4周。
取大鼠纹状体组织50 mg,加入1 ml Trizol液,充分匀浆,22℃,静置5 min,加入氯仿0.2 ml,颠倒15 s,22℃,静置3 min,离心:4℃ × 14,000转/分 × 15 min,取上清液0.5 ml,加入0.5 ml异丙醇,混匀,22℃,静置10 min,离心:4℃ × 14,000转/分 × 10 min,弃上液,加入1 ml 4℃ 75%乙醇,离心:4℃ × 10,000转/分 × 5 min,弃上液,真空干燥5 min,用40 ul DEPC处理水溶解,−80℃保存。
F(GCTATGCTGACTGGGCTGAC);R(TTTCAGGGATGCTGCCTCT)反转录环境:37℃ 15 min,85℃ 5秒。−20℃保存。PCR反应条件为95℃ 30秒;95℃ 3 s,60℃ 30 s,40个循环。
目的基因的相对表达量可以采用∆∆CT法加以分析。CT值—n:扩增循环,∆CT = 目的基因CT − 内参C (注:同一反转录产物扩增后),∆∆CT = 观察样本∆CT − 对照样本∆CT = (观察样本目的基因CT − 观察样本内参CT) − (对照样本目的基因CT − 对照样本内参CT),样本的相对表达量:= 2−∆∆CT。
参照张旺明等 [
采用双复管法(每个样本分为9个不同浓度反应管,重复测定2次)测定,反应管内加入浓度呈倍比递增的标记配基(特异性结合:10、20、40、60、80和100 ul;非特异性结合:20、60和100 ul)和非标记配基(非特异性结合:100 ul)以及定量的膜蛋白液0.2 ml,加入Buffer缓冲液,使每管总反应体积为0.4 m1,37℃水浴中孵育15 min,于冰浴中终止反应。以多头细胞样品收集器收集于玻璃纤维滤纸上,置80℃烘箱中烤干,剪下样品,以2000CA/LL型液态闪烁计数仪测定其放射活性,以空白滤纸点样进行校正。计算各点特异性结合计数,使用受体数据软件包(上海第二医科大学编制),按Scanchard公式计算出多巴胺受体的最大结合容量(Bmax, fmol∙mg)和平衡解离常数(KD, nmol∙L)。
所有数据以均数士标准差(
与治疗前(第0天)比较,模型组大鼠用药后第14、、21和28天的AIM评分逐步增高(P < 0.01);中药干预组第14天AIM评分较治疗前升高(P < 0.05),14天后AIM评分逐步降低,至第28天评分显著低于治疗前(第0天)。与同期模型组比较,中药干预组大鼠第7天AIM评分差异无统计学意义,自第14天起的AIM评分值低于同期模型组(P < 0.05)。见表1,图1。
与治疗前(第0天)比较,模型组大鼠用药后第7、14、21和28天的剂峰旋转次数逐步增高(P < 0.05),中药组自第14天起剂峰旋转次数逐步增高(P < 0.01),中药干预组大鼠自第14天起的旋转评分值低于同期模型组(P < 0.01)。见表2,图2。
组别 | n | 检测时间 | ||||
---|---|---|---|---|---|---|
0 Day | 7th Day | 14th Day | 21st Day | 28th Day | ||
模型组 | 8 | 34.63 ± 2.97 | 38.75 ± 3.11 | 48.50 ± 9.55** | 51.88 ± 6.60** | 53.88 ± 5.06** |
中药干预组 | 8 | 33.13 ± 5.87 | 38.13 ± 9.05 | 40.50 ± 6.19△ | 31.50 ± 2.45△△ | 27.00 ± 2.56△△ |
表1. 两组大鼠AIM评分比较(
图1. 两组大鼠AIM评分比较
损毁侧模型组、中药干预组与正常对照组比较Bmax显著升高(P < 0.01),模型组上升幅度最大;KD值较之正常对照组,各治疗组均明显降低(P < 0.05);中药干预组与模型组比较,Bmax降低,KD值升高(P < 0.01)。健侧模型组较之正常对照组Bmax升高,KD值降低(P < 0.01),中药干预组较之正常对照组Bmax升高(P < 0.01),其余无明显差异。模型组、中药干预组损毁侧较健侧Bmax升高,KD值降低(P < 0.01)。见表3。
损毁侧模型组、中药干预组与正常对照组比较D1受体mRNA表达显著升高(P < 0.05),模型组上升幅度最大;中药干预组与模型组比较,D1受体mRNA表达降低(P < 0.01)。健侧模型组、中药干预组较之正常对照组D1受体mRNA表达明显升高(P < 0.01),其余无明显差异。模型组损毁侧较健侧D1受体mRNA表达升高(P < 0.05)。见表4,图3。
组别 | n | 检测时间 | ||||
---|---|---|---|---|---|---|
0 Day | 7th Day | 14th Day | 21st Day | 28th Day | ||
模型组 | 8 | 128.50 ± 4.96 | 137.38 ± 9.09* | 151.63 ± 6.57** | 175.88 ± 6.03** | 179.88 ± 5.99** |
中药干预组 | 8 | 131.25 ± 6.90 | 133.25 ± 8.05 | 147.25 ± 7.27** | 154.38 ± 9.61**△△ | 156.25 ± 9.87**△△ |
表2. 两组大鼠剂峰旋转次数比较(
组别 | n | Bmax(fmol/mg) | KD(nmol/L) | ||
---|---|---|---|---|---|
损毁侧 | 健侧 | 损毁侧 | 健侧 | ||
正常对照组 | 8 | 1118.99 ± 86.84 | 1075.22 ± 90.92 | 2.499 ± 0.289 | 2.554 ± 0.216 |
模型组 | 8 | 1653.63 ± 59.88**## | 1440.80 ± 55.37** | 0.730 ± 0.035**## | 1.858 ± 0.126** |
中药干预组 | 8 | 1390.97 ± 52.40**△△## | 1306.00 ± 51.64** | 1.342 ± 0.063**△△## | 2.485 ± 0.197 |
表3. 各组大鼠双侧尾壳核多巴胺D1受体活性变化(
注:与正常对照组比较,*P < 0.05,**P < 0.01;与模型组比较,△P < 0.05,△△P < 0.01;与健侧比较,#P < 0.05,##P < 0.01。
图2. 两组大鼠剂峰旋转次数比较
组别 | n | 损毁侧 | 健侧 |
---|---|---|---|
正常对照组 | 8 | 1.081±0.128 | 0.987±0.129 |
模型组 | 8 | 1.567±0.172**# | 1.363±0.095** |
中药干预组 | 8 | 1.320±0.211*△△ | 1.153±0.118** |
表4. 各组大鼠双侧尾壳核多巴胺D1受体mRNA相对表达量比较(
图3. 两组大鼠剂峰旋转次数比较
目前,关于异动症的发生机制仍不清楚,有学者 [
本次实验结果显示:模型组大鼠随着LD腹腔注射时间的延长,AIM评分进行性升高,剂峰旋转次数亦进行性升高,异动症症状愈发加重。模型组大鼠多巴胺D1受体活性明显增加,基因表达上调,直接通路激活。所以我们认为,LID的发生主要是多巴胺D1受体所介导的直接通路功能活化所引起,当直接通路活化时,由纹状体释放并传递至GPi和SNr的主要神经递质GABA含量增加,对GPi和SNr的抑制作用增强,使后者对丘脑的抑制作用减少,使其释放的兴奋性神经递质Glu增加 [
滋肾平颤颗粒源于熟地平颤方,以滋补肝肾、通络解毒为基本思路,是已故上海市名老中医胡建华教授治疗帕金森病的经验总结方。临床应用数十年,治疗PD疗效显著 [
多巴胺D1受体介导的直接通路过度激活可能是帕金森病异动症产生的主要机制。滋肾平颤颗粒主要是通过下调多巴胺D1受体活性及基因表达从而有效缓解异动症症状。
国家自然科学基金面上项目:熟地平颤方抑制α-突触核蛋白错误折叠及异常聚集防治帕金森病的深化研究(项目编号:81673726);上海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划(项目编号:ZY3-JSFC-2-1007);国家中医临床基地龙医学者-育苗计划:(项目编号:LYTD-34);上海市卫计委杏林新星人才计划项目(ZY3-RCPY-2-2005)。
叶青,高东雯,周洁,袁晓蕾,袁灿兴. 滋肾平颤颗粒对异动症大鼠行为学及纹状体多巴胺D1受体活性和基因表达的影响Effect of Zishenpingchan Granule on Neurobehavioral Manifestations and the Activity and Gene Expression of Striatal Dopamine D1 Receptors of Rats with Levodopa-Induced Dyskinesias[J]. 中医学, 2017, 06(02): 118-126. http://dx.doi.org/10.12677/TCM.2017.62020